非洲猪瘟诊断方法研究综述

田志革，于 瑞，廖晓夏，李 晓，李映春，殷忠伟，胡晓亮

（1.宜宾学院农林与食品工程学部，四川宜宾；2.宜宾学院动物多样性与生态保育宜宾市重点实验室，四川宜宾644000）

非洲猪瘟（African Swine Fever, ASF）是一种急性、烈性、高度接触性传染病，死亡率可高达100%；其病原为非洲猪瘟病毒（ASFV），可自然感染家猪和野猪，软蜱是其贮藏宿主和媒介[1].该病发病过程短，以发热及淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血为主要特征.1900 年，非洲东部地区爆发非洲猪瘟，1921 年肯尼亚首次报道了非洲猪瘟病毒能够引起家猪出现发热、出血等症状，且死亡率达100%，随后疫情蔓延至非洲大部分地区；并于1957 年传入葡萄牙[2]，于1990 年在西班牙流行，随后迅速蔓延至整个欧洲.2007 年在俄罗斯爆发[3]后向周边国家不断蔓延，2018 年8 月3-15 日，在辽宁沈阳、河南郑州、江苏连云港3个相隔很远的地区，接连发现3起非洲猪瘟疫情；截至2019 年11 月21 日，我国共报告发生160 起非洲猪瘟疫情.非洲猪瘟病毒已在我国形成比较大的污染面，预计后期仍将呈点状发生[4].该病的流行严重威胁食品安全及养猪业的发展，造成巨大的经济损失，是世界动物卫生组织（OIE）法定报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病[5].

1 病原

ASFV属DNA病毒目非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是目前已知唯一的虫媒DNA病毒；病毒粒子具有双层囊膜二十面体对称结构，大小为（175 ～215）nm.基因组为线性双链DNA 分子，有一个血清型，22个基因型.

该病毒耐干燥或酸性环境，但对热环境敏感，在（60 ～70）℃条件下加热10 min 可使其灭活，对乙醚、氯仿等敏感，易被脂溶剂、消毒剂、胰酶等灭活[6].

依据毒力不同，可将ASFV 分为高致毒性、中等毒力、低毒力、感染无临床症状毒株等[7].该病毒主要通过消化道和呼吸道侵入机体，通过巨胞饮及网格蛋白介质的胞吞作用感染宿主单核巨噬细胞并进行复制，后期可扩散至全身其他细胞，导致猪免疫系统受损，随后进入血液，引起器官出血等[8].

2 流行病学

猪是该病的主要宿主，任何年龄、品种的猪感染概率都很高，尤其是家猪和野猪，目前还没有证实该病毒可以向人类传播.如果将健康猪和患病猪放在一起，或者在泔水、饲料、垫料等传播媒介的影响下，都极易传播非洲猪瘟[9]，此外，被污染的器具、车辆、衣物等均是该病的传染源；交配、舔咬等直接接触也可传播病毒.

3 症状

非洲猪瘟的潜伏期为（5 ～19）d[10]，根据引起症状的不同分为最急性型、急性型、亚急性型、慢性型.

（1）最急性型：无临床症状，病猪突然死亡，死亡率可高达100%.

（2）急性型：体温升高至42 ℃，病猪表现出明显的倦怠状态，进食量下降，在眼鼻周围有大量的黏性分泌物流出，出现呕吐、便秘等临床症状，在粪便中存在大量血液和黏液[11]，呼吸困难，妊娠期的母猪会流产.

（3）亚急性型：临床症状与急性型相似，病情较轻，但病情时间更长，为（5 ～30）d，死亡率为30% ～70%，有出血症状，体温一般不低于40.5 ℃.

（4）慢性型：咳嗽及呼吸困难，并且伴有消瘦、发育缓慢、毛发颜色浅等不良症状.病猪关节肿胀，局部皮肤出现坏死或溃疡死亡率较低，但会受病毒的持续感染，康复猪是该病毒携带者.

4 病理变化

病猪剖检的特点是肾皮质颜色变淡，有点状出血；脾脏肿大，大概为正常的5 ～10 倍，呈暗红色或黑色，质地较脆，梗死明显；下颌淋巴结以及肠系膜有明显的出血，切面呈大理石状；肺脏变硬，有明显的出血；胃浆膜膜面出现弥漫性出血，膀胱黏膜出血，回肠结肠处有“扣状肿”.

5 诊断方法

ASF 的实验室检测方法分为病原检测和血清抗体检测方法.应用范围较广、技术发展迅速的方法主要有分子生物学方法及血清学检测方法.

5.1 分子生物学检测方法

（1）PCR.目前实验室最常用的检测方法即为聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）.根据其基因组高度保守区域设计特异性引物进行常规PCR 扩增，因其具有良好的敏感性和特异性而成为最早期的快速诊断病毒感染方法；荧光定量PCR 方法较常规PCR 方法具有更高的特异性和敏感性，根据ASFV 的保守基因（如VP72、VP73、P54、K205R 基因）设计引物和探针建立TaqMan 实时荧光定量PCR，能特异性鉴别ASFV，或建立双重荧光定量PCR 方法，可同时用于鉴别非洲猪瘟和猪瘟病毒[12-13]；巢式PCR 法是变异的PCR 方法，该方法需要2 对PCR 引物；第一对引物扩增片段和普通PCR 相似，第二对引物结合在第一次PCR 产物内部，因此该方法比单次PCR 具有更好的特异性和敏感性，可用于检测蜱中ASFV的感染[14].

（2）重组酶聚合酶扩增-RPA.RPA 是新型核酸检测技术，其具有很好的灵敏度和特异性，反应时间短，在临床鉴别诊断、检验检疫、病原监测等方面具有巨大的开发前景.王建昌等[15]基于ASFV VP72基因保守序列建立了ASFV RPA 等温检测方法，在38 ℃水浴锅中反应30 min 即可对目的片段进行有效扩增；李林等[16]建立的实时荧光RPA 法，只需要20 min 就可完成检测，最低可检测到16 拷贝/反应.但该检测方法需要专门的试剂盒，成本较高.

（3）线性指数PCR 技术.线性指数PCR 是一种不对称的PCR，其基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA，主要用于核酸序列测定.Ronish 等[17]根据ASFV VP72 基因建立了线性指数PCR 方法，病毒DNA 检出限可达约1 拷贝，敏感性高.

（4）微滴数字PCR 技术（ddPCR）.ddPCR 是新兴的一种绝对定量的扩增技术，扩增前对样品进行微滴化处理，每个微滴不含或含有一个至数个待检核酸靶分子，通过PCR 扩增，对微滴逐个检测；该方法不依赖标准样品，不需要建立标准曲线，即可实现绝对定量，灵敏度高，已被应用于HIV等多种病毒的检测中[18-20].邬旭龙等[21]基于ASFV K205R 基因保守区设计特异引物建立了ASFV 的ddPCR 检测方法，结果表明该方法具有灵敏度更高、特异性更强，重复性好等优点，应用前景较好.

（5）环介导恒温扩增技术（LAMP）.LAMP 技术是在恒温下进行的核酸扩增方法，其特征是对目标DNA 链上的6 个区段设计4 个不同的引物，然后利用链置换型DNA 合成酶在（60 ～65）℃温度下进行反应，经过一个步骤即可完成，操作方法简单，扩增效率极高，对仪器设备没有特殊要求，适合基层诊断使用.江彦增[22]利用ASFV 的P72基因C 端保守序列设计筛选4 套LAMP 引物，建立了LAMP 检测技术，灵敏度高，可靠性好，与其它病原没有交叉反应.

（6）原位杂交技术（In Situ Hybridization, ISH）.ISH 是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸（即探针）与组织、细胞或染色体上待测DNA 或RNA 互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来.Oura 等[23]建立了针对AS⁃FV vp73 基因的原位杂交技术，用于检测ASFV 在感染猪不同组织中的分布.该方法操作繁琐，对操作人员要求高，不适合于ASFV 的快速检测，更多应用于ASFV致病机理等的研究.

（7）探针杂交技术.张鑫宇等[24]基于ASFV p72基因保守序列建立了检测ASFV 的纳米金探针杂交方法.检测核酸浓度达到10 fmol/L，特异性及灵敏性高，且在酶标板中可批量反应，开辟了ASFV 检测新途径.但是该方法需要合成特异性探针并进行标记，对操作技术要求较高.

5.2 血清学检测方法

5.2.1 抗体检测方法

（1）酶联免疫吸附法（ELISA）.ELISA 方法的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记.此方法方便快速，敏感特异，可使用自动化设备检测大量样本，是目前使用最广泛的血清学检测技术，是OIE指定的ASFV首选的血清学诊断方法；常用的抗原蛋白有P72、P73、P30、P32、P54 等，曹琛福[25]利用pET-52b(+)原核表达系统成功将非洲猪瘟病毒特异性P54 蛋白实现可溶性表达，基于VP54 蛋白建立竞争ELISA 法，其结果特异性达到100%，特意性强，灵敏度高达96.22%.

（2）胶体金免疫层析技术-GICA.胶体金免疫层析技术以胶体金为显色媒介，利用免疫学中抗原抗体能够特异性结合的原理，在层析过程中完成反应从而达到检测的目的.该方法在10 min 内可得到检测结果，无需特殊设备，灵敏度和准确性高.张鑫宇等[26]通过原核表达及纯化获得ASFV 的p54 重组蛋白，建立了p54 抗体的胶体金检测方法，特异性强，敏感性高，阳性符合率较OIE 推荐的ELISA 方法高.吴海涛[27]根据双抗体夹心原理，制备了针对VP72 蛋白的多抗和单抗，建立了ASFV 胶体金免疫层析试纸条检测方法，特异性较好；Giménez⁃Lirola等[28]利用ASFV 的p30 蛋白抗体建立了双基质间接ELISA 方法，用于检测猪口腔液和血清中的ASFV 抗体.此法检测速度快、特异性强、灵敏度高、操作简单、成本低，适用于现场检测.

5.2.2 抗原检测

（1）荧光抗体试验（FAT）.FAT 方法利用荧光标记单抗用于分离病毒和组织的检测，是OIE 推荐用于ASFV 抗原鉴定的方法，可以用于鉴定不产生红细胞吸附试验反应的ASFV 毒株.FAT 使用异硫氰酸荧光素结合的特异性抗体检测猪组织细胞内ASFV抗原，但必须通过显微镜观察感染脏器涂片或薄层冷冻片上的病毒抗原实现，且对亚急性和慢性病例的检出率较低[29].

（2）双抗夹心ELISA.双抗夹心ELISA 是基于ELISA 方法建立的检测方法.此方法是在特异性抗体与固相载体联结，然后加入待检测抗原，再加入酶标抗体，最后结合底物显色，根据呈色的深浅进行定性或定量分析.Vidal等[30]建立针对ASFV VP73 蛋白的双抗夹心ELISA 方法，对VP73 蛋白的检出限为0.05 μg/mL，对 全 病 毒 粒 子 的 检 出 限 为2.3×102PFU/mL.

（3）侧向流动免疫色谱分析-LFA.LFA 是利用生物学物质或化学物质相互特异性附着的性质，快速定性或定量分析的检测方法.Gao 等[31]建立了交叉引物扩增结合免疫层析条快速检测ASFV 的方法，检测限可低至200拷贝.

6 展望

自2018 年我国首例非洲猪瘟发生以来，非洲猪瘟疫情在我国迅速蔓延，对养猪业及人们日常生活造成重大影响.目前，尚无有效的市场化的非洲猪瘟疫苗，因此，只有早发现、早确诊，对病猪进行无害化处理才能有效控制该病的蔓延与传播.各地应根据现有条件，选择合适的检测方法加强自检，另外，科研单位将需加大诊断方法研发力度，不断开发高通量、耗时短、易操作、设备简单的适应现地及基层诊断需要的诊断方法.