石油污染土壤生物修复技术研究进展

张腾飞，黄玉杰,季蕾,王加宁

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 山东省科学院生态研究所 山东省应用微生物重点实验室，山东 济南 250103)

石油是由各种烷烃、环烷烃、芳香烃等烃类和非烃类化合物组成的复杂混合物[1]，在促进世界经济发展中发挥着举足轻重的作用[2]。操作不当等人为原因以及意外发生的事故等均会导致石油在勘探开采、运输、加工冶炼的过程中发生泄漏、溢出和排放[3]。

石油渗透到土壤中，一半以上的难挥发性污染物质会滞留在其中，直接影响土壤的理化性质和群落结构，例如堵塞土壤颗粒之间的孔隙，降低含水率，改变土壤中的营养结构等，威胁生物的生存[4]。作为“生产者”的部分植物在受到石油污染土壤的影响后，通过食物链传递到“消费者”动物体内，将危害动物的生长和繁殖[5]，沿着食物链毒性会不断地放大，甚至会危害人类的健康。土壤是人类赖以生存的重要自然资源，国内外专家已高度重视石油污染土壤问题，石油污染的治理刻不容缓。

目前国内外有物理修复、化学修复、生物修复等技术改善石油污染土壤现状。土壤置换、气相抽提等物理修复技术在一定程度上能够取得很好的修复效果, 但是存在治理成本较高、潜在危险性较大、污染物降解效率低等不足，目前该项技术已被逐渐淘汰而退出市场。热脱附、电动修复等技术，工艺新颖但修复成本较高，处理不当又会引起二次污染。化学修复技术的发展早于物理修复，也相对成熟。化学氧化、光催化氧化、等离子体降解等技术可应用于修复目标要求比较严格、周期短的污染土壤，其修复效果好，对污染物降解速率快，但该技术修复成本较高，容易产生二次污染，修复过程中土壤的理化性质、有机质、微生物结构等会发生变化，这是由于氧化剂等化学试剂过量使用或使用不当造成的。微生物、植物、微生物-植物联合等生物修复技术具有操作简单、成本低、有机物降解彻底的特点，相比物理和化学等方法安全可靠、无二次污染，能实施原位处理，对环境的扰动性低，可以高效降解污染物，修复范围广泛。但是生物修复技术存在特异性高效降解菌株稀少、降解效率低等问题，导致实际场地应用困难。本文对微生物、植物、联合修复等3种生物修复技术进行综述，以期为国内石油污染土壤生物修复领域的应用提供参考。

1 生物修复技术研究进展

生物修复是指利用植物、微生物、原生动物等生物自身的代谢功能，吸收、转化、降解环境当中的污染物，最终实现环境的净化、生态的恢复[6]。20世纪70年代，世界各国陆续展开了污染土壤修复的相关研究，国外最早开始此类研究的是英国、爱尔兰、德国、美国、日本等国家，制定了一系列石油污染土壤的修复方案。对于污染土壤修复的研究，我国起步较晚，主要历经了三个阶段[7]： 第一阶段即20世纪80年代之前，该阶段的任务是以物理修复为主的土壤治理，相继展开了很多对土地资源的稳定化应用；第二阶段即20世纪90年代，此阶段的土壤修复有了很大的进步，物理修复、化学修复、生物修复都有应用，但主要的还是对土地的复垦；第三阶段即21世纪以来，该阶段的土地治理方式较前两个阶段来说，又有了进一步的研究，具体修复技术包括气相抽提、热脱附、生物炭吸附、化学氧化、微生物修复、植物修复、微生物-植物联合修复等，其中的研究重点就是微生物修复、植物修复、微生物-植物联合修复。总的来说，我国对生物修复技术的研究仍处于起步阶段，对石油污染土壤的修复工作还有很长的路要走。

1.1 微生物修复技术

微生物修复技术就是土壤中的土著微生物在适宜的生存环境下利用其代谢功能，或者通过促进或强化具有污染物降解能力的外源功能微生物群的代谢活动，最终消除污染物的生物修复技术[8]，其本质是生物的降解或者生物的转化[9]。微生物对石油烃类的降解主要是由胞内酶的催化作用完成的[10]，降解过程是：降解石油烃类的微生物通过分泌表面活性剂乳化污染物，被乳化后的污染物进一步黏附在细胞膜表面并以某种特定的方式进入细胞，这种方式包括主动转运或被动转运、胞吞作用等，在胞内污染物与相应的酶进行酶促反应以达到降解的目的[11]。

微生物降解链烷烃、环烷烃、芳香烃等各种石油烃类的机理各不相同。链烷烃的降解途径可分为单末端氧化、双末端氧化和次末端氧化等三种氧化方式，不同的氧化方式在碳链上的不同位置进行，最终形成醇、醛、酸和辅酶A(coenzyme A，CoA) 等物质，然后进行β氧化为微生物的生命活动提供能量[11]。环烷烃的降解过程与链烷烃稍有不同：环烷烃一开始被羟化酶氧化生成环烷醇，环烷醇与氢原子反应形成环烷酮；在酮加氧酶的作用下，环烷酮转化为己内酯，然后一个H2O分子与己内酯作用来破坏环结构；环结构被打开后进一步生成6-羟基己酸，6-羟基己酸被6-羟基己酸脱氢酶氧化为6-氧己酸，经乙醛脱氢酶氧化进而形成二羧酸；最后，通过三羧酸循环进一步氧化二羧酸，维持微生物的生命活性[12]。相比较其他烃类，芳香烃的降解更为复杂。苯环数相同的芳香烃，由于其降解的位点不同，具体的降解情况也不同。例如，节杆菌和分枝杆菌对菲有多个降解途径，但它们对菲的开环位置不同，可能形成2-羟基-1-萘酸或2,2 -联苯二酸等产物[13]。单环芳烃的初始氧化物是顺式二氢-二羟基化合物，脱氢后形成二醇环氧化物，二醇的环氧裂解形成对应的醇并产生水杨酸、儿茶酚和龙胆酸等产物继续氧化。开苯环的链烃通过烷烃氧化途径形成羧酸，羧酸与CoA反应生成乙酰CoA，乙酰CoA通过TAC(三羧酸循环)为自我代谢提供能量[14]。对多环芳烃来说，其降解途径基本类似。多环芳烃的其中一个苯环被氧化形成反式二氢-二羟基化合物或被微生物酶催化进而发生反应被微生物降解。四环以上的多环芳烃，随着苯环数量的增加，微生物很难直接进行降解，只能通过共代谢氧化降解。

目前，研究表明细菌、真菌、放线菌、酵母菌和霉菌中100属的200多种微生物都能够有效地降解石油烃类污染物。细菌的生物降解效率可以达到0.13%～50.00%，海洋细菌的降解率则高达100%[15-16]，常见的细菌有假单胞菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、放线菌属等[17-18]。真菌可以降解6%～82%[17-18]的烃类污染物，包括木霉属、青霉属和曲霉属、假丝酵母菌属、红酵母属[19]等。具有降解烃类污染物能力的细菌、真菌、藻类等微生物被许多学者研究和报道[20]。近175个属的细菌、真菌能够将石油烃等碳氢化合物分解成二氧化碳和水[11]，利用合适的微生物降解石油，一些有毒有害的石油烃类污染物可以降解成无害物质[21]。不同种属的菌株或菌群可以降解不同种类的石油烃类污染物，而降解有机污染物的主要微生物是细菌[22]。

近年来，从分子水平研究了生物大分子的结构与功能，利用分子生物学、基因工程等技术对微生物的蛋白质、核酸(遗传因子)等进行了深入探索，通过筛选和构建高效降解菌株，提高现有菌株的降解能力，可以为今后微生物修复技术的改善提供基础[23]。微生物具有遗传多样性[24]，分子方法通过检测土壤中最丰富的微生物种群，在一定程度上能够揭示微生物群落的结构进而促进对微生物的研究。目前盛行的高通量测序系统16S rRNA基因焦磷酸测序技术是研究环境中细菌群落的有效方法[25-26]，应用于检测环境样品中的微生物群落和多样性，该技术已在石油污染土壤的修复领域取得了一些成果[27]。

1.2 植物修复技术

植物修复技术就是利用生态系统植物的根系或者茎叶部分彻底清除土壤、水体和大气中的污染物的技术[32]。该技术利用植物来处理各种各样的环境污染问题，包括修复被碳氢化合物和其他有毒有害物质污染的土壤和地下水。不同的机制即水力控制、植物挥发、根修复和植物转化均可用于多种污染物的修复。植物修复在污染修复领域是比较有前景的，该技术的优势包括成本效益、美学优势和长期适用性[33]。此外，利用植物修复作为原位处理的二次抛光步骤，可以最大限度地减少土地干扰，降低与场外处理和处置相关的运输和责任成本，既环保又经济，但由于植物修复是一个自然发生的过程，该技术的修复周期相对较长[33]。

植物修复石油污染土壤的具体表现为植物根际能够吸收土壤中的石油烃类污染物，污染物在植物内部实现转化，该过程实现污染物在植物根际微域的矿化和降解的物质是植物自身所释放的各种分泌酶以及酶类，经过较长时间的修复，污染土壤的生态功能逐渐得到恢复[34]。外部的环境条件、污染物的性质、植物的种类等3个因素主要影响植物降解污染物，而污染物的性质即污染物的生物有效性则是决定植物降解土壤中的石油烃类等有机污染物的关键。植物修复过程中对污染物的降解作用主要集中在根系附近[35]，该过程体现了植物与微生物之间的共生关系，植物根际分泌物(糖类、醇类、酸类)为微生物的生长发育提供了大量所需的营养元素，提高了微生物降解石油烃类污染物的能力，微生物的代谢产物反过来又促进了植物的生长，这种发生在植物与微生物之间的共生关系就是最具有潜力的土壤修复技术[36]。该技术应用的关键在于筛选出高效降解植物，这也是目前限制植物修复技术发展的主要原因。

为了实现植物修复的最优化，就要因地制宜地选择植物的种类，植株要表现出对特定污染物的耐受性，同时还要保证自身能够正常地生长。唐景春等[37]研究了生长在大港油田周边的植物，通过设置不同植被类型和处理方式(土壤调理剂)等两种实验条件，探讨植物对污染土壤的降解效果以及降解效率。实验发现，植被类型方面，碱蓬、大豆等植物的降解效率要明显高于芦苇、苜蓿；土壤调理剂对石油污染土壤修复的效果方面，商业添加剂最显著，远大于牛粪和蛭石。丁正等[38]对狗牙根、黑麦草、高羊茅修复效果的规律性和相关性进行了研究，发现相关性方面，TPH(石油类污染物)降解率与茎鲜重和茎干重呈显著正相关；规律性方面，TPH 降解率与TPH降解菌数量的变化规律一致。董亚明等[39]研究了芦苇、沙枣、柽柳3种植物对石油污染土壤的修复效果，其中芦苇的效果最好，这3种植物都可以很大程度提高土壤中植物根际的微生物数量，土壤的酶活性也明显得到改善。

1.3 联合修复技术

联合修复技术是为了克服单项修复技术的局限性，结合两种或两种以上修复方法，实现对场地污染物的处理和对污染土壤修复的技术,能够极大程度地提高污染土壤的修复速率与效率[40]，联合修复囊括了物理、化学、生物修复技术的优势，利用各项修复技术的联合作用，对土壤中的石油烃类污染物进行分解，最终实现土壤环境的修复和改善。微生物-植物联合修复、微生物-物理/化学联合修复、物理-化学联合修复等都包括在该项修复技术的范畴内，微生物-植物联合修复则是目前研究比较热门的领域。

微生物-植物联合修复就是利用二者之间的协同共生作用，富集与降解土壤中污染物的过程。所谓的协同共生就是植物利用自身的代谢活动为微生物的生存提供场所、氧气、营养物质等条件，以此来保证土壤中根际微生物的正常生长，微生物在植物的根际或体内生长繁殖，为植物抵抗外部环境提供保障，微生物的代谢活动同时还可以使有机污染物的存在形态发生改变，加快石油烃类等有机污染物的降解和矿化。

在微生物-植物联合修复体系中，植物与微生物之间的协同共生需要对植株与菌株有所要求，只有二者的有机结合才能使石油烃类等有机污染物的降解实现最大化。对于植株来说，要最大可能地提供微生物活动的根表面的面积，就是必须有旺盛的须根系，同时根系能够延伸到较深的土层中[41]；此外，植株的生命力要旺盛，对污染物要表现出一定的抗性。对微生物而言，自身对污染物要具有较高的代谢降解能力，且能够很好地适应植株周边的外部环境，重要的是微生物要能够和植株共生。目前，微生物-植物联合作用机理的研究主要有：(1)植株根际通过代谢活动改善土壤的理化性质，为微生物生长所需的微生态环境给予保障；(2)植物根际分泌的物质可以在活化污染物质的同时刺激、强化微生物的降解过程，或分泌酶类物质直接参与到污染物质的降解过程中；(3)根际的微生物要利用自身的功能达到强化的植株的效果[42-43]。

2 研究展望

2.1 存在问题

进入21世纪后，为了追求经济的快速发展，许多国家不断地开发利用石油资源，与此同时造成了相当严重的石油污染问题。石油资源的使用在带动社会经济的良性循环和可持续发展的同时，给生态环境带来了不可估量的破坏，各种生物修复技术在研究、应用过程中也存在着很多问题。

(1)缺乏高效降解菌。所选择的高效降解微生物需要对环境中的污染物有较高的适应性和耐受力，同时不破坏环境中原有土壤的理化性质以及原有微生物的多样性，而目前缺乏高效率降解污染物的特异性菌株。

(2)降解效率低下。微生物修复、植物修复、联合修复等各项技术均能够达到一定的修复效果，同时也存在一定的应用限制和不足，对污染物的降解效果不是很理想。

(3)环境条件制约。外部及土壤环境对生物降解影响很大，温度、湿度、pH、氧气、营养物质、氧化还原电位、表面活性剂等均会影响微生物、植物等生物的生长进而影响生物降解。

(4)实际场地应用受到限制。当前国内学者大多数开展的研究都是在实验室条件下进行的，具有人为可操作性，但是在实际污染场地的修复中由于与实验室环境差异太大，往往难以开展修复工作。

(5)石油污染形势日益严峻。世界各国一直致力于提倡使用清洁能源，但柴油、汽油等石油相关产品的使用并没有因此而减少，世界范围内石油烃类污染物的量仍很大，对人们的生产、生活带来的负面影响也越来越明显。

2.2未来发展方向

近年来我国学者围绕石油污染所带来的环境问题、污染物迁移规律、石油污染防治修复技术开展了大量的科学研究，取得了显著的成绩。为解决生物修复技术存在的诸多问题，今后国内应在以下几方面加强研究：

(1)深入掌握生物修复的原理，利用修复过程的基因调控机制构建基因工程菌，提高菌株对特定环境的耐受性和适应性，获得高效降解菌株。

(2)生物修复技术应用前景广阔、修复潜力巨大，今后应该根据污染土壤的特性、污染情况，将微生物修复与植物修复有机结合、综合运用，构建石油污染土壤的高效降解体系，提高降解率。

(3)在实际汽油和柴油等石油土壤场地的修复中由于与实验室环境差异太大，开展修复工作比较艰难。为解决场地石油污染土壤问题，应加强对污染场地的研究，把研究成果运用到现场中去。

(4)完善生物修复技术的环境风险等级和评价体系，减少治理过程中产生的不必要的风险。

3 结论

作为一种高效率、低成本、无污染的修复技术，生物降解土壤石油污染物无论是在基础研究还是在实际应用方面均取得了很大的进展，将是我国未来土壤修复领域研究的热点。面对我国复杂的石油污染土壤环境问题，大规模利用生物降解土壤污染物、治理环境污染将对未来的国民经济可持续发展具有重要的现实意义。