葛根素联合有氧运动对非酒精性脂肪肝大鼠SIRT1介导肝细胞自噬的保护作用研究※

金秋芳 梁国强 葛惠男 包晓敏 孙 柳 恽海峰

(南京中医药大学附属苏州市中医医院保健科，江苏 苏州 215009)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种无过量饮酒史，病变主体在肝小叶，以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综台征，常伴有肥胖或超质量，很容易发展为肝硬化，继而转为肝细胞癌的风险增加[1]。当前研究表明，NAFLD负向转归进展过程中，大量肝细胞线粒体存在受损情况，而细胞内存在的自噬机制能够清除受损的亚细胞器，维持肝细胞内的稳态，是细胞存活的关键[2]，自噬可降解肝细胞内脂滴，减轻炎性反应，改善肝细胞脂肪变性[3]。依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶(NAD+)的沉默信息调节因子1(SIRT1)可调节多种与线粒体增殖和自噬相关的转录因子的表达及活性，对维持肝细胞内稳态平衡具有极其紧密的关联性[4]。临床实践及既往研究发现，单纯控制饮食、适度的有规律有氧运动可延缓NAFLD的病理进展，并最终改善患者生存质量，对于改善肝脏脂质代谢紊乱、外周胰岛素抵抗(IR)和机体的抗氧化能力降低等均有一定作用，但仍存在患心血管疾病和癌症的风险[5-6]。

中医防治NAFLD越来越显示出独特优势，与现代的运动医学、预防医学和康复医学等既有交叉又有特色。未病先防、既病防变和瘥后防复为中医倡导“治未病”的主要思想，通过饮食起居、情志调理、运动疗法及中医药等多种措施调节人体的阴阳气血平衡，增强抗病能力[7]。葛根素是中药葛根的主要活性成分，药理研究表明其有改善心血管功能、保护血管内皮细胞、降低血糖和改善IR的作用[8]。目前多数研究仅对饮食运动或药物单方面干预NAFLD的作用机制进行研究，缺乏运动联合中药主要成分对SIRT1介导肝细胞自噬的保护作用研究。因此，我们通过动物实验研究葛根素联合有氧运动对NAFLD大鼠肝细胞自噬相关蛋白调控的影响，同时观察SIRT1介导细胞自噬的交互机制，探讨其治疗作用和可能机制，为中药活性成分联合运动防治NAFLD提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠53只，体质量180～220 g，购自昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2017-0043。自由摄食、饮水，室温24±2 ℃，明暗各半。

1.1.2 实验药物 葛根素(阿拉丁控股集团有限公司)；羟甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司)；戊巴比妥钠(美国Sigma公司)；甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)测定试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司)；苏木素、伊红(广州鸿泉生物科技有限公司)；戊二醛固定液、锇酸固定液、醋酸铀染色液、柠檬酸铅染色液(阿拉丁控股集团有限公司)；Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ抗体[艾博抗(上海)贸易有限公司]；p62(美国Cell Signaling Technology公司)；SIRT1抗体(美国GeneTex公司)；广谱二抗(上海长岛生物技术有限公司)；多聚甲醛(上海医药集团股份有限公司)；其他试剂均为市售分析纯。

1.1.3 实验仪器 大鼠有氧运动游泳箱(吴门医派研究院中心实验室自制，1.5 m×1.0 m×0.5 m)；全自动生化分析仪(美国杜邦公司)；酶标仪(Infinite F50型，瑞士Tecan公司)；石蜡切片机、摊片机(湖北徕克医疗仪器有限公司)；超薄切片机(LKB-V型，瑞典LKB公司)；透射电镜(H-600型，日本日立公司)；数码相机(D5100型，日本NIKON公司)；正置显微镜(CX41型，OLYMPUS公司)；聚偏二氟乙烯(PVDF，迈博瑞生物膜技术有限公司)；TBST(Tris-HCl，NaCl，tween20)缓冲液[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；超敏化学发光(ECL)液(美国默克公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将53只SD大鼠适应性饲养1周后，按照随机数字表法分为空白组10只，造模组43只。

1.2.2 造模 造模组43只大鼠予高脂饲料(普通饲料+猪油100 g/kg+胆固醇20 g/kg)，自由饮水；空白组10只大鼠予普通饲料饮食。均喂养10周。最后1次喂养结束后，从造模组大鼠中随机选取3只大鼠，处死验证造模成功[9]。随后将造模组剩余40只大鼠按照随机数字表法分为模型组、葛根素组、运动组及葛根素+运动组，各10只。

1.2.3 给药方法 葛根素组、葛根素+运动组大鼠予葛根素250 mg/kg(葛根素以0.5%羟甲基纤维素钠溶解为25 mg/mL混悬液)，灌胃容积为10 mL/kg，每日上午灌胃给药，现用现配；空白组、模型组、运动组大鼠予等容积的双蒸水灌胃，每日1次。均灌胃4周。运动组、葛根素+运动组大鼠于第1、2、3 d在水温28～32 ℃有氧运动游泳箱内分别适应性游泳30、60、90 min，以后运动方案固定，参照文献[10]，每日固定时间(上午9：00左右开始)游泳90 min，每周运动5 d，持续4周。空白组、模型组、葛根素组大鼠关在笼中不运动。

1.2.4 标本制作 末次灌胃干预后，禁食不禁水18 h，以戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主动脉采血，分离血清并用冻存管分装，置于-80 ℃冰箱中保存；采血后解剖摘取肝脏。剪取肝组织约0.5 cm3若干块，置于10%多聚甲醛液固定，用于制作病检标本。另摘取小块肝组织，戊二醛固定液固定(4 ℃保存)，待透射电镜下观察线粒体及自噬体超微结构。余下肝组织，-80 ℃保存，待蛋白质印迹(Western Blot)法测定相关蛋白。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 血清学相关指标检测 在全自动生化分析仪上采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶偶联(GPO-PAP)比色法检测血清TG、TC，双试剂直接法检测HDL-C、LDL-C；采用紫外比色法检测血清ALT、AST，酶联免疫吸附(ELISA)法检测IL-1β、TNF-α水平。

1.3.2 肝组织正置显微镜、电镜病理形态学观察 取各组经10%多聚甲醛液固定的肝组织，采用苏木素-伊红(HE)染色法，进行脱水透明、浸蜡包埋、切片、脱蜡、染色、封固后，正置显微镜下观察肝组织形态及脂滴分布状况,并采用数码相机拍照。另取戊二醛固定液固定的肝组织，依次行锇酸固定、脱水包埋、使用超薄切片机切片、醋酸铀和柠檬酸铅染色，根据要求进行透射电镜观察拍照分析。

1.3.3 肝组织Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、SIRT1蛋白检测 采用蛋白质印迹(Western Blot)法检测肝组织Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、SIRT1蛋白表达，取肝组织裂解、匀浆后留取上清，行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，分离并转移到PVDF膜上，室温孵育1 h，封闭过的膜对应抗体，4 ℃过夜，TBST缓冲液洗膜，然后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜。与ECL试剂作用，X线摄片记录实验结果。以GADPH为内参照，采用imag J图像处理软件测定蛋白。

2 结 果

2.1 各组大鼠治疗前后体质量比较 见表1。

表1 各组大鼠治疗前后体质量比较

由表1可见，治疗前后模型组、葛根素组、运动组、葛根素+运动组大鼠体质量均高于空白组(P<0.05)。治疗后葛根素组、运动组、葛根素+运动组大鼠体质量均低于模型组(P<0.05)；葛根素+运动组大鼠体质量均低于葛根素组、运动组(P<0.05)；治疗后葛根素与运动组大鼠体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组大鼠治疗后血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较 见表2。

由表2可见，模型组TC、LDL-C均高于空白组(P<0.05)，HDL-C低于空白组(P<0.05)；葛根素组、运动组、葛根素+运动组TG、TC、LDL-C均低于模型组(P<0.05)，HDL-C虽高于模型组但比较差异无统计学意义(P>0.05)。运动组TC高于葛根素组(P<0.05)，葛根素+运动组TC、LDL-C均低于葛根素组(P<0.05)。葛根素+运动组TC、LDL-C均低于运动组(P<0.05)。

表2 各组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比较

2.3 各组大鼠治疗后血清AST、ALT及IL-1β、TNF-α水平比较 见表3。

表3 各组大鼠治疗后血清AST、ALT及IL-1β、TNF-α水平比较

由表3可见，与空白组比较，模型组AST、ALT、IL-1β、TNF-α水平均明显升高(P均<0.05)；与模型组比较，干预各组AST、ALT、IL-1β水平均明显下降(P<0.05)，葛根素+运动组TNF-α水平明显下降(P<0.05)；与葛根素组比较，运动组AST、ALT、IL-1β、TNF-α水平均上升但比较差异无统计学意义(P>0.05)；葛根素+运动组AST、ALT、IL-1β、TNF-α水平均低于葛根素组、运动组(P<0.05)。

2.4 各组大鼠肝组织病理形态学观察

2.4.1 镜下(HE染色)结果 空白组肝组织肝小叶结构良好，肝板排列整齐，未见炎性细胞浸润和脂肪变，细胞核圆形均质红染；模型组肝小叶结构破坏，肝板排列紊乱，可见肝细胞肥大呈气球样变和脂肪空泡性变，可见炎性细胞浸润，并且部分肝细胞核则被脂滴挤得明显偏位；与模型组比较，干预各组大鼠肝组织病理形态学改变均有不同程度的改善，以葛根素+运动组改善最为明显，肝小叶结构和肝板大多排列趋向良好和整齐，炎性细胞浸润和脂肪滴明显减少。见封2，图1。

2.4.2 透射电镜结果 空白组的肝细胞整体清晰，线粒体结构正常，嵴机构和内外膜完整，各细胞器排列分布均正常，内质网、核糖体、粗面内质网、溶酶体、细胞器丰富，自噬结构体偶见。模型组电镜下可见脂滴弥漫性分布，肝细胞可见大小不一的空泡细胞和内质网肿胀，核糖体脱落，线粒体数量增加且形态异常变扁圆，各细胞器存在缺失情况，多成无序排列，可见少量自噬体结构。与模型组比较，干预各组的肝细胞内部脂质体相对减少，线粒体空泡化、不规则性的异常变化均有不同程度的改善，且细胞轮廓趋向正常，以运动+葛根素组自噬溶酶体及被包裹的内容物明显增多。见封2，图2。

2.5 各组大鼠肝组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p62、SIRT1蛋白表达比较 见表4。

表4 各组大鼠肝组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin-1、p62、SIRT1蛋白表达比较

由表4可见，模型组大鼠肝组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p62、SIRT1表达均高于空白组(P<0.05)。葛根素组、运动组、葛根素+运动组大鼠肝组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均低于模型组(P<0.05)，葛根素组、葛根素+运动组大鼠肝组织Beclin-1均高于模型组(P<0.05)，葛根素组、葛根素+运动组大鼠肝组织p62均低于模型组(P<0.05)，葛根素组、运动组、葛根素+运动组大鼠肝组织SIRT1均高于模型组(P<0.05)。与葛根素组比较，葛根素+运动组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ升高，运动组Beclin-1降低，p62运动组升高，葛根素+运动组降低(P均<0.05)。与运动组比较，葛根素+运动组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1均升高，p62降低(P均<0.05)。

3 讨 论

现代社会人们饮食结构多样，NAFLD、2型糖尿病和代谢综合征等与IR相关的代谢性疾病逐年增加。随着全民健康意识的不断提高，合理膳食、运动已广泛应用于多种疾病的防治中[11]。有文献分析及前期研究表明，现代运动医学、预防医学和营养学等防治NAFLD发挥了重要作用[12]，与传统中医学“未病先防、既病防变”理念不谋而合。单纯的中药活性成分治疗可明确降低血脂，改善肝损伤，配合规律性的有氧运动后，可改善肝细胞功能，在降低血脂、改善IR情况下，改善脂肪在肝脏内沉积[13]。本实验采用高脂膳食诱导的NAFLD模型大鼠进行4周干预研究，结果显示葛根素联合有氧运动可明显降低NAFLD模型大鼠体质量及血脂、肝功能、炎症因子指标，病理组织学改变也得到明显改善，与既往关于葛根素或有氧运动干预脂肪肝的研究结果一致[14]。

现代医学研究证实，NAFLD的主要诱因之一是肝细胞线粒体功能障碍，主要体现为肝细胞线粒体中超微结构损伤及自噬体阶段性浮动变化等[15]。本实验的肝细胞线粒体及自噬体超微结构观察结果显示，NAFLD大鼠肝组织电镜下可见肝细胞脂滴弥漫性分布，大小不一的空泡性细胞，内质网肿胀、核糖体脱落和线粒体数量增加及形态扁圆等细胞器缺失的情况，又可见少量自噬体结构[16]。葛根素联合有氧运动干预下可明显改善线粒体损伤，同时观察到自噬溶酶体及被包裹的内容物明显增多。进一步的Western Blot法检测结果显示，与模型组比较，葛根素+运动组肝细胞自噬标志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62表达下调，Beclin-1表达上调，p62和Beclin-1理论上虽然优于单一干预的葛根素组和运动组，但LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于单一干预的葛根素组和运动组，提示葛根素联合有氧运动对NAFLD大鼠肝细胞自噬保护作用尚需进一步研究[17]。

SIRT1作为组织细胞中沉默信息调节因子2家族成员之一，主要是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，是其自我保护的一种重要分子，在机体细胞周期、细胞衰老、凋亡和新陈代谢等方面的调节中发挥重要作用，在NAFLD肝组织内通过蛋白质和组蛋白的去乙酰化导致基因转录和蛋白质功能的上调或下调，能提高线粒体的生物源和功能，也能导致各种代谢途径的改变[18]。本实验Western Blot法检测结果显示，模型组肝组织中SIRT1表达与空白组比较差异无统计学意义，葛根素组、运动组、葛根素+运动组SIRT1表达均明显上调。既往研究SIRT1去乙酰化活性的调控作用已被证明对NAFLD的病理生理机制存在一定关联性，尤其对细胞自噬、凋亡均具有积极作用[19]。因此提示，葛根素联合有氧运动协同调节SIRT1-肝细胞自噬通路，改善NAFLD转归，机制可能为作用肝细胞SIRT1信号通路，提高SIRT1的表达和活性。推断其通过去乙酰化作用而抑制核转录因子κB(NF-κB)p62蛋白积聚或激活自噬小体的形成等，调控自噬的相关蛋白表达，进入程序性死亡，而防止非程序性死亡。

随着对NAFLD研究的不断深入和人们健康意识的不断提高，结合体育运动和传统中医治未病“先安未受邪之地”的思想，加强相应的干预研究是必然趋势。有规律、合适的运动配合药食同源的植物活性成分可协同降低NAFLD风险。因此，研究葛根素联合有氧运动协同缓解NAFLD“二次打击”的恶性循环的进程，调控SIRT1介导细胞自噬的抗NAFLD分子机制，探讨抗NAFLD过程中可能的靶点、途径及调控机制，为有效的中药活性成分联合有氧运动防治NAFLD提供更多的实验依据具有积极意义。