肉类及肉制品中动物源性成分鉴别方法研究进展

纪艺,陈笑芸,丁霖,汪小福,彭城,徐晓丽,徐俊锋

浙江省农业科学院农产品质量安全与营养研究所， 杭州 310021

近年来，肉类掺假问题成为食品安全热点话题之一，肉类及肉制品掺假是指用成本更低的其他肉类或植物蛋白质来部分或全部替代生肉及肉制品[1-4]。由于马肉的价格是牛肉的三分之一，2013年，英国、法国等在内的部分欧盟国家的一些不法商贩将马肉掺入到牛肉中进行售卖[5]；由于狐狸肉本身存在异味，价格较为低廉，但经处理后，可脱去其臭味，2013年年底，我国国内媒体曝光沃尔玛在售的“五香驴肉”被检出狐狸肉[6]。肉类掺假不仅侵害了消费者的利益，也存在诸多食品安全隐患。因此，亟需溯源肉类及肉制品中的动物源性成分，确定肉类成分的真实性和准确性，向消费者提供肉类及肉制品的清晰、可靠的信息[7]。

如今，对动物源性成分分析的研究及相应的鉴别方法逐渐增多。传统的检验方法主要是通过感官辨别、显微镜法以及比色法等鉴别不同肉类[8-9]，也可通过化学方法检验不同动物种类糖原结合肌内脂肪、脂肪中的亚油酸、胡萝卜素、脂肪的折射率以及碘含量等进行综合判断[8]。随着抗体技术的不断发展，因免疫学方法可精准地确定动物源而在肉类成分鉴别中更多地出现[10]。其中，通过免疫测定获得定量数据的最佳方法是微孔板ELISA，它适用于高精度定量靶标表征[11-12]。随着实际应用对检测技术的要求逐渐提高，基于核酸鉴定和定量动物源性成分的方法发展起来[13]，研究证明基于核酸的肉类鉴定是准确、快速且敏感的[14]。Cai等[15]开发了一种基于实时环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的测定法，并且设计了对猪基因具有高度选择性的引物，用于检测肉制品中猪源成分。此方法仅需20 min，是在商业产品中使用实时LAMP测定法检测猪源成分的首次尝试。Ren等[16]开发了一种新的基于微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)的检测方法，用于定量测定绵羊和山羊肉产品中鸡肉的含量，并引入常数(乘法因子)以将拷贝数的比例转换为肉的比例。可见，高效、精准的检测方法有助于鉴别食品工业中的掺假行为。基于此，本文对肉类及肉制品中动物源性成分检测及鉴别的不同研究方法进行介绍，并分析个中利弊，最后对此领域的后续研发方向进行展望，以期为肉类及肉制品的安全监控、检测以及溯源提供一定的参考。

1 传统鉴别方法

早期人们通过感官来鉴别动物肉的种类。如猪肉及其脂肪的物理特征(包括颜色、质地和气味等)不同于其他肉类，猪肉显示出柔软的稠度、略带腥味以及高比例的肌内脂肪，这些表象属性可用于猪肉的感官识别[17]。此外，属于物理鉴别方法的还有镜检法，是唯一一个被欧盟认可的检测肉制品中动物源性成分的官方方法[17]。镜检法可以通过对哺乳动物、禽类和鱼类等的肉质进行观察并予以区分，但不能进一步鉴别具体的种类。此外，也可以通过不同动物种类之间的糖原含量、碘值等化学参数来区分动物源。如将猪肉和其他肉类进行区分的另一个因素是猪肉的高折射率(index of refraction，RI)(马肉除外，马肉RI值与猪肉相同)[18]；王新来[19]利用理化学鉴别的方法，通过测定脂肪溶解度以及糖原的定性反应成功鉴别牛、马肉。这些传统的鉴别方法虽然可以得到鉴别结果，但是在实际应用中却存在许多限制因素：耗时长、灵敏度低，而且，肉糜类产品相对较难通过传统方法进行检验[19-21]。

2 免疫学鉴别方法

免疫学方法因可精准地确定动物源而被应用于肉类成分鉴别中，如利用试管沉淀法、琼脂凝胶免疫扩散法均能够鉴别动物肉类源性成分[10]。李景鹏和张玉树[22]利用对流免疫电泳、琼脂凝胶扩散和环状沉淀反应3种方法对马肉、牛肉以及其混合肉(共87份样品)进行鉴别，结果表明这3种方法均可精准地鉴别出其动物源，但是大部分方法耗时较长，且无法进行有效的定量分析。除耗时较长外，上述方法无法检测出热处理后的蛋白质[10,23-24]，而大部分市售的肉制品均是被高温处理过的，因此在实际应用中受到限制。

免疫学检测方法中另一具有代表性的是基于抗原-抗体特异性识别的酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)，其利用酶来检测样品中抗体或抗原的存在，具有特异性、简便性和敏感性等特点，近年来在动物源性成分鉴别中得到广泛的应用[25-26]。Mandi等[27]开发了ELISA/免疫传感器(包括直接免疫传感器和竞争性免疫传感器两种形式的ELISA)用于检测肉类掺假情况。与竞争性ELISA(在45 min内确定0.1%的掺假水平)相比，直接ELISA能够在14 h 15 min内检测出牛肉中0.01%的低掺假水平的猪肉。使用直接免疫传感器，可以在2 h内检测到0.1%的猪肉掺假；而使用竞争性免疫传感器，仅20 min即可检测到低水平的猪肉掺假(0.01%)。研发的免疫传感器可有效检测加工食品中的猪肉免疫球蛋白(IgG)，并且可以在1%～100%的研究范围内检测煮熟后牛肉丸中的猪肉，并已成功应用于物种(鸡、羊肉、火鸡)筛选测试。2种竞争性免疫测定均显示出高灵敏度、良好的特异性、简便性和低成本等优点，因此适用于食品认证[28-30]。此外，多克隆抗体和单克隆抗体均可用于ELISA方法中进行源性成分鉴定。多克隆抗体具有许多优点，如识别抗原不同表位的混合物，对抗原性质的微小变化(如聚合或轻微变性)具有更大的耐受性，因此是检测变性蛋白质的首选，但同时也存在局限性，如亲和力可变、产量受限以及需要大量纯化程序以消除针对特定物种鉴定的交叉反应性[31]。

3 基于光谱的检测方法

光谱技术是近年来常用于检测肉品新鲜度的方法，具有无损、快速得出结果等特点。基于光谱的检测方法包括近红外光谱(near infrared spectrum instrument，NIRS)法、拉曼光谱检测(raman spectra，RS)法和傅里叶近红外光谱等，其中，近红外光谱可以对肉类质量参数进行估算并用于检测肉类是否掺假，操作简便、检测速度快，是一种经济高效的方法[32]。许多研究将近红外光谱和偏最小二乘法(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)算法结合进行肉类检验。如白京等[33]运用近红外光谱法结合化学计量法对牛肉汉堡中是否掺假猪肉进行鉴别，研究表明，利用支持向量机(support vector machine，SVM)和PLS-DA算法可进行定性鉴别，且后者效果较好，而利用最小二乘回归法(partial least squares regression regression，PLSR)算法可进行掺假比例的定量检测，获得了目标结果。Parastara等[34]通过将便携手持式近红外光谱技术与最新的分类算法相结合，开发了一种可用于鉴别鸡肉真实性的方法。结果显示，基于近红外光谱从冻融的肉中区分出新鲜的肉，而且可以根据鸡的生长条件对鸡柳进行正确分类。这说明手持式NIR结合机器学习算法是一种有用、快速、无损的工具，可以识别鸡肉掺假情况。通过测量NIR光谱，为消费者和食品检验机构展示了检查包装鸡柳的真实性和来源的可能性[35]。Ainara等[36]通过研究结合化学计量技术的近红外光谱的可行性，来检测切碎的羊肉和牛肉与其他类型肉类混合的掺假行为，该研究准备了不同占比的纯羊肉和纯牛肉样品以及混合牛羊肉样品，使用不同的技术对光谱数据进行预处理，并通过主成分分析(principal component analysis，PCA)进行探索，以找出纯样品和混合样品之间的差异。此外，对每种类型的肉混合物进行PLS-DA，最终获得较好的分类率。这项研究显示了将NIRS与PLS-DA结合使用来检测碎羊肉和牛肉中掺假情况的可能性。光谱技术具有很多优势，如准确度高、检测速度快等[37-39]，但是对于不同的样品，需建立相对应的模型，并且需要一个相对庞大的数据库，对数据进行降维及提取信息等操作较为繁琐[40-42]。

4 基于核酸的鉴别方法

随着实际应用中对鉴别技术的要求不断提高，基于核酸的检测技术正在迅速发展，包括环介导等温扩增技术和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，其中PCR又可分为实时定量PCR、数字PCR技术等。以核酸为基础来鉴别肉及肉制品是否掺假，避免了由于食品加工出现的检测误差，稳定性较高，检测更准确，灵敏度更高[9]。

4.1 环介导等温扩增技术

全球食品研究越来越重视肉类现场真伪检测，所以在实际检测中，准确并且有效地进行现场检测过程至关重要。环介导等温扩增技术(LAMP)由Notomi等[43]于2000年首次开发。该技术的优点是可以在恒定温度下以高特异性和灵敏度来快速、有效地扩增目的片段。LAMP方法中没有DNA变性步骤，因此不需要复杂的温度控制设备，从而使核酸扩增过程摆脱了精密仪器的束缚，可以满足现场检测的需要，花费时间短，具有鉴定物种真实性的绝佳前景[1]。Abdulmawjood等[44]开发了一种基于非洲鸵鸟线粒体DNA的细胞色素b基因的环介导等温扩增分析方法，并与荧光定量PCR结合使用。此系统能够检测出0.01%的鸵鸟肉，对于检测鸵鸟肉具有极好的灵敏度和特异性，并且从采样到得到结果仅需15～20 min。Zahradnik等[45]研究用于检测加工食品中的马肉，针对靶向马(Equuscaballus)的线粒体基因组设计了特异性环介导等温扩增引物，可检测出0.1 ng的马DNA，并可检测出制备的模型香肠中0.1%的马肉。虽然LAMP技术具有高灵敏度、操作简单、便携且可快速检测等优点，但是LAMP不适用于痕量水平的定量，且原理较为复杂，存在实验设计要求高、引物设计复杂、扩增的靶序列长度需小于300 bp等缺点[46]。

4.2 聚合酶链式反应

由于具有物种之间丰富的多态性以及与其他生物分子相比的高稳定性，DNA是源性成分鉴定的理想目标，聚合酶链式反应是检测肉类是否掺假的应用最广泛的方法之一[47-49]。Druml等[50]提供了一个单一的实时PCR分析方法，可测定肉制品中鹿的含量[小鹿(Damadama)、马鹿(Cervuselaphus)和梅花鹿(Cervusnippon)的总和]，从而检测食品掺假。同时对猪肉中含有等量小鹿、马鹿和梅花鹿的肉混合物以及野味香肠的分析表明，定量方法非常准确(系统误差通常<25%)。基于牛特异性和脊椎动物通用引物，Li等[51]开发了一种新颖、高效、可靠的双向SYBR Green实时定量PCR(qPCR)方法，用于牛肉产品掺假检测。通过分析双链PCR产物的熔解曲线峰的数目、位置，对样品中的牛源性成分进行鉴定，并初步筛选牛肉产品中的非牛源性成分；同时，可根据峰的面积比对牛肉的百分比进行半定量。该方法不仅可以有效地鉴定样品中是否含有牛DNA，而且还可以初步筛选出非牛和半定量牛在总肉成分中的百分比。从DNA序列、DNA扩增产物的热力学特性以及DNA的荧光信号中可以获得许多信息，随后使用该研究中的分析方法可以实现对样品中物种组成的鉴定和定量。但是聚合酶链式反应耗时较长、成本较高，且需建立标准曲线确定样品的拷贝数，还要克服潜在的问题(如扩增效率的差异等)[16]。

此外，用于检测不同动物源性成分DNA的方法还有数字PCR(dPCR)，即通过对单个模板分子进行计数，在使用荧光靶标特异性水解探针进行PCR扩增后，可以检测其阳性扩增。与定量PCR相比，dPCR的优势在于其具有更高的灵敏度和精确度。此外，无需进行标准曲线的绘制，即可提供绝对的核酸浓度测量拷贝数值[52-53]。定量PCR的精度受到限制，因为它无法精准地区分小于2倍的差异，并且微量浓度(<1%)的定量通常不准确。相比之下，数字PCR可以检测到≤30%的基因表达差异[54]。数字PCR比荧光定量PCR更能耐受抑制剂[53]，并且由于在不同的反应中进行分配，它对许多可能影响PCR的因素(如交叉反应DNA模板和引物二聚体)具有较强的抵抗力[55]。使用微滴式数字PCR，可以检测低浓度模板，具有绝对定量的特点，可精确定量肉类和加工肉制品中的不同种类[56]。但是数字PCR成本较高，许多实验室尚不具备数字PCR相关仪器，这也是限制数字PCR在各个领域应用的原因之一[57]。

5 展望

随着经济的发展，人们的生活水平日益提高，更多追求的是生活品质，尤其是食品质量安全，如何快速检测肉类及肉制品的源性成分，以便随处可检测、随时可监测，是我们现在并着眼于未来所需要解决的问题。蛋白质在暴露于高温、高压、强酸度、高碱度、重金属盐和其他条件下时容易变性，所以基于蛋白质的检测技术不能准确地处理深加工食品。基于蛋白质的检测方法中，对于未来亟待改进的方面包括：建立相应的各个产品模型的数据库，便于快速在线分析；开发有效的算法，高效提取特征数据；与其他鉴别手段联用，同时达到鉴别准确率高、速度快、检出限低、无损等优势。基于分子水平的检测技术，一方面，进一步研究成本更为低廉、更高效、更灵敏且快速的检测方法；另一方面，由于系统逐渐完善、体系逐步优化，有待开发一系列能够对肉类成分进行快速、准确、灵敏检测的试纸条或试剂盒，以满足大多数实验室的研究，为保障食品安全、有效溯源肉类成分提供充足、有效的参考依据。