LncRNA NBAT1通过调控miR-3664-5p/Caspase 9分子轴对人乳腺癌细胞增殖的影响

赵云霞 牛 波

近年来乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，发病率排在女性恶性肿瘤的首位[1-2]。其最主要的治疗手段依然是外科手术和化疗[3]。但是，肿瘤细胞耐药的出现严重影响了乳腺癌治疗效果[4]。因此，探究乳腺癌发生发展的分子机制，寻找新的生物治疗靶点依然是目前亟待解决的重大课题[5]。

长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是指转录长度大于200个核苷酸并且不翻译成蛋白质的功能性RNA分子。lncRNA与人类健康和疾病密切相关[6-8]。大量研究表明lncRNA在肿瘤发生发展中发挥重要功能，lncRNA与乳腺癌发生、发展密切相关[9-10]。目前已鉴定出HOTAIR、FBXL19-AS1、H19等乳腺癌相关lncRNA[11-12]。成神经细胞瘤相关转录本1(Neuroblastoma associated transcript 1，NBAT1)是一种肿瘤抑制基因，其表达缺失与成神经细胞瘤增殖能力密切相关[13]。近期发现，NBAT1也在骨肉瘤、脑胶质瘤、肺癌细胞的发生发展中发挥着重要的作用[14-16]。但是，关于lncRNA NBAT1在乳腺肿瘤中的作用机制尚不十分清楚，本研究将重点探讨其在乳腺癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7购自中国科学院细胞库；mimics miR-3664-5p和ASO-miR-3664-5p及其对照购自上海吉玛制药技术有限公司；过表达质粒载体(pcDNA3-NBAT1)和对照质粒载体(pcDNA3-NC)购自天津赛尔生物技术有限公司；MCF-10A专用DMEM/F12培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；RT及PCR引物均由金唯智公司合成，miR-3664-5p的RT引物序列为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACACTCATG-3′；U6的RT引物序列为5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAAAA TATGGAAC-3′；NBAT1上游序列为5′-CTCCACCCATTTGTAAGC-3′，下游序列为5′-AATACCCATGAGTCCATAC-3′；GAPDH的上游序列为5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游序列为5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′；miR-3664-5p的上游序列为5′-TGCGGAACTCTGTCTTCACTCATG-3′，U6上游序列为5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′，miR-3664-5p和U6的下游均为5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

1.2 细胞培养及其转染

细胞系MCF-10A置于含5%马血清，10 μg/mL胰岛素，20 ng/mL表皮生长因子，100 ng/mL霍乱毒素，0.5 μg/mL氢化可的松的DMEM/F12专用培养基中，人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7均置于含10%FBS的DMEM培养基中，37℃、5%CO2恒温培养箱中常规培养。选择对数生长期、生长状态良好，表达lncRNA NBAT1最低的MCF-7细胞用于后续转染实验。当MCF-7细胞融合至70%～80%时，pc-NC组和pc-NBAT1组分别转染pcDNA3-NC载体和pcDNA3-NBAT1载体， pc-NC+mimics NC组、pc-NBAT1+mimics NC组及pc-NBAT1+mimics miR-3664-5p组分别转染pcDNA3-NC+mimics NC、pcDNA3-NBAT1+mimics NC及pcDNA3-NBAT1+mimics miR-3664-5p，转染均按照脂质体Lipo8000TM说明书进行。

1.3 RNA提取，逆转录及实时荧光定量PCR

收集MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7常规培养细胞，及MCF-7细胞pc-NC组和pc-NBAT1组转染后48 h细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，经NanoDrop分析仪检测，OD260/OD280为1.8～2.0。根据逆转录试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA。NBAT1的定量检测以GAPDH为内参，miR-3664-5p的定量检测以U6为内参，均采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.4 Western blot法检测Caspase 9蛋白表达

收集MCF-7细胞pc-NC组、pc-NBAT1组转染后48 h细胞，用RIPA裂解细胞，提取细胞中的总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。取各组蛋白样品30 μg进行SDS-PAGE电泳，用PVDF转膜，加入Caspase 9以及GAPDH一抗(1∶1 000)孵育过夜，加入HRP标记的二抗室温孵育2 h，TBST洗涤后，在ECL发光液下显影，用Bio-rad凝胶成像系统曝光并对图像进行分析。

1.5 双荧光素酶报告验证

采用美国Promega公司的pmirGLO双荧光素酶报告基因检测系统，分别化学合成lncRNA NBAT1、Caspase 9的3′UTR区与miR-3664-5p的结合位点序列片段，并插入 pmirGLO luciferase表达载体中，获得野生型载体pmirGLO/NBAT1和pmirGLO/Caspase 9-UTR，同样的方法合成突变序列，获得突变型载体pmirGLO/NBAT1-m和pmirGLO/Caspase 9-mUTR，将pmirGLO/NBAT1和pmirGLO/Caspase 9-UTR野生型载体、pmirGLO/NBAT1-m和pmirGLO/Caspase 9-mUTR突变型载体、mimics miR-3664-5p模拟物或者反义核酸ASO-miR-3664-5p及阴性对照组分别与Lipo8000TM 脂质体混合后转染293T细胞，转染48 h后，收集细胞。按照双荧光素酶报告基因试剂盒说明书，并以海肾荧光值作为内参。计算萤火虫荧光值与海肾荧光值的比值，评估报告基因在细胞中的相对活力。

1.6 CCK-8检测细胞增殖能力

MCF-7细胞接种至96孔板中，每孔细胞数为5×103个。pc-NC组、pc-NBAT1组或pc-NC+mimics NC组、pc-NBAT1+mimics NC组及pc-NBAT1+mimics miR-3664-5p组转染24 h、48 h、72 h、96 h、118 h后，每孔中同时加入90 μL新鲜的含10%胎牛血清的培养液和10 μL的CCK-8溶液，然后置于37℃、5%CO2的培养箱中反应4 h。用免疫酶标仪测定各孔在450 nm 处的吸光度OD值，以各组平均值反映细胞增殖能力。

1.7 平板克隆分析

pc-NC组、pc-NBAT1组或pc-NC+mimics NC组、pc-NBAT1+mimics NC组及pc-NBAT1+mimics miR-3664-5p组转染24 h后，200个细胞/孔接种于12孔板，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，每隔2天换液1次。15天后，弃去培养基，甲醇固定20 min后，每孔加入400 μL的1%结晶紫染色液，室温染色10 min，水漂洗5 min，观察实验结果。

1.8 统计分析

2 结果与分析

2.1 lncRNA NBAT1的表达量

通过在线软件Starbase分析TCGA数据库发现lncRNA NBAT1在1 104例乳腺癌组织中的表达量显著低于其在113例正常乳腺组织中的表达量(P<0.001)(图1A)。lncRNA NBAT1在正常对照细胞株MCF-10A细胞中表达量最高，在MDA-MB-231和MDA-MB-453细胞中其表达量比MCF-10A低(P<0.001)，在MCF-7细胞中其表达量最低(P<0.001)(图1B)。

2.2 生物信息学预测lncRNA NBAT1、miR-3664-5p、Caspase 9三者的关系及双荧光素酶报告系统验证

运用Targetscan数据库进行了生物信息学分析，预测miR-3664-5p和lncRNA NBAT1及Caspase 9的结合位点(图2A、2B)。并使用pmirGLO双荧光素酶报告系统进行了进一步验证，检测结果显示，mimics miR-3664-5p能够抑制荧光素酶表达(P<0.001)，ASO-miR-3664-5p能够促进荧光素酶表达(P<0.001)，但是当miR-3664-5p结合位点突变后，抑制和促进作用均消失(图2C、2D)，进一步证明lncRNA NBAT1可以吸附miR-3664-5p，同时Caspase 9是miR-3664-5p的靶基因。

2.3 过表达lncRNA NBAT1对MCF-7中miR-3664-5和Caspase 9表达的影响

lncRNA NBAT1过表达载体pcDNA3-NBAT1和对照载体pcDNA3-NC分别转染乳腺癌细胞株MCF-7，qPCR方法检测pc-NBAT1组lncRNA NBAT1的表达较pc-NC组增高(P<0.001)；qPCR检测pc-NBAT1组miR-3664-5的表达较pc-NC组降低(P<0.001)；Western blot检测pc-NBAT1组Caspase 9蛋白的表达较pc-NC组增高(P<0.001)(图3)。

2.4 CCK-8和克隆形成检测细胞的增殖能力

CCK-8和克隆形成检测过表达lncRNA NBAT1后细胞的增殖能力降低；如果同时将lncRNA NBAT1过表达载体和mimics miR-3664-5p转染MCF-7细胞，观察发现miR-3664-5p过表达能够缓解过表达lncRNA NBAT1对细胞增殖的抑制效应(图4)。

图1 lncRNA NBAT1在组织和细胞系中的相对表达量Figure 1 The expression of lncRNA NBAT1 in breast tissues and breast cell linesNote：A.The expression of lncRNA NBAT1 in breast cancer and normal tissues；B.The expression of lncRNA NBAT1 in breast cancer cell lines and normal cell line.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，when compared with the MCF-10A group(n=3).

图2 lncRNA NBAT1、miR-3664-5p、Caspase 9三者的靶定关系的预测及验证Figure 2 The predicted binding sites of miR-3664-5p in lncRNA NBAT1 and Caspase 9 by the dual-luciferase reporter systemNote：A.The predicted binding sites of miR-3664-5p in lncRNA NBAT1 and lncRNA NBAT1 mutant sequences；B.The predicted binding sites of miR-3664-5p in Caspase 9-UTR and Caspase 9-mUTR sequences；C.Dual-luciferase reporter analysis for the miR-3664-5p binding to lncRNA NBAT1；D.Dual-luciferase reporter analysis to confirm that the Caspase 9 was a target-gene of miR-3664-5p.***P<0.001，when compared with the mimics NC group(n=3).

图3 MCF-7细胞过表达NBAT1后对miR-3664-5和caspase9表达的影响Figure 3 The effect of lncRNA NBAT1 on the expression of miR-3664-5 and Caspase 9Note：A.qPCR analysis for the relative expression of lncRNA NBAT1 in MCF-7 cells transfected with pcDNA3-NBAT1 and pcDNA3-NC plasmids；B.qPCR analysis for the relative expression of miR-3664-5p in MCF-7 cells transfected with pcDNA3-NBAT1 and pcDNA3-NC plasmids；C.Western blot analysis for the relative protein expression of Caspase 9 in MCF-7 cells transfected with pcDNA3-NBAT1 and pcDNA3-NC plasmids.***P<0.001，when compared with the pc-NC group(n=3).

图4 CCK8和克隆形成实验检测lncRNA NBAT1对MCF-7细胞的增殖能力影响Figure 4 The effects of lncRNA NBAT1 on proliferation of MCF-7 cells by CCK-8 and colony formating assaysNote：A.The effect of lncRNA NBAT1 on proliferation of MCF-7 cells by CCK8 assay；B.The effect of lncRNA NBAT1 on proliferation of MCF-7 cells by colony formating assay；C.CCK-8 assay for the rescue effect of miR-3664-5p on the proliferation of MCF-7 with lncRNA NBAT1 overexpression；D.Colony formation assay for the rescue effect of miR-3664-5p on the proliferation of MCF-7 with lncRNA NBAT1′s overexpression.***P<0.001，when compared with the pc-NC group(n=3).

3 讨论

lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的内源性非编码单链RNA，lncRNA可以通过染色质重塑、转录调控以及转录后调控等方式参与机体的表观遗传调控。lncRNA参与了细胞增殖分化、神经发育、免疫稳态、肿瘤发生等生命过程[6]。lncRNA在乳腺癌的研究有许多进展，lncRNA FBXL19-AS1在乳腺癌中高表达，通过抑制has-miR-718，促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭[11]。lncRNA-PANDAR在乳腺癌组织及细胞系中高表达，可以抑制p16的表达，促进乳腺癌细胞的增殖[17]。lncRNA NBAT1在乳腺癌中的作用并不清楚，研究其在乳腺癌发生、发展中的作用，将有助于更加全面地了解乳腺癌发生发展的机制。

在本研究中，通过对TCGA数据库中lncRNA NBAT1的表达分析比较，发现lncRNA NBAT1低表达于乳腺癌组织当中。lncRNA NBAT1可能在乳腺癌的发生发展过程具有一定的调控作用。为进一步探讨lncRNA NBAT1在乳腺癌细胞中的生物学功能，本研究应用重组质粒在乳腺癌MCF-7细胞中特异性过表达lncRNA NBAT1，通过CCK-8和克隆形成实验进一步证实，过表达lncRNA NBAT1对MCF-7细胞增殖能力有明显抑制作用。lncRNA的作用机制较为复杂，其中一种重要机制即是作为分子海绵与microRNA结合进而抑制其对下游相应靶mRNA的沉默效应。通过Targetscan在线生物信息学网站的检索表明，miR-3664-5p可能是lncRNA NBAT1的结合分子之一。综上可推测，lncRNA NBAT1的抗乳腺癌细胞增殖作用可能是通过吸附miR-3664-5p的来实现的。为证实这一假说，本研究通过过表达MCF-7细胞内lncRNA NBAT1，采用RT-qPCR检测发现，过表达lncRNA NBAT1可明显抑制MCF-7细胞内miR-3664-5p的表达水平。Targetscan在线预测网站分析表明Caspase 9基因是miR-3664-5p的下游抑制靶点。Caspase 9是内源性凋亡通路中关键蛋白酶，处在凋亡相关基因Caspase顶端[18]。Caspase 9可以激活细胞凋亡途径中的最关键酶Caspase 3，从而促进细胞的凋亡。因此，它的活化对于整个内源性凋亡通路的激活尤为重要。通过进一步研究发现，在过表达lncRNA NBAT1后MCF-7细胞内Caspase 9的表达水平也有所提高，细胞增殖受到明显抑制。至此，本研究初步表明lncRNA NBAT1的作用机制是通过吸附miR-3664-5p发挥作用，进而释放对Caspase 9的抑制作用而实现的。同时通过双荧光素酶报告系统进一步验证miR-3664-5p和Caspase 9的靶向关系。

综上所述，lncRNA NBAT1在乳腺癌组织中表达降低，主要通过减少miR-3664-5p的吸附，进而抑制Caspase 9的表达而促进了乳腺癌细胞的增殖。lncRNA NBAT1作为与乳腺癌密切相关的新分子，有可能成为乳腺癌治疗的潜在靶点。