基于RNAi技术的转基因植物监管现状及其面临的育种领域的挑战

黄春蒙, 朱鹏宇, 王智, 王晨光, 杜智欣, 魏霜, 张永江, 付伟*

1.中国检验检疫科学研究院, 北京100176；

2.中国农业大学植物保护学院, 北京100193；

3.南宁海关技术中心, 南宁 530029；

4.广州海关技术中心, 广州 510623

在全球转基因作物商业化种植的第23个年头，全球转基因作物应用(用作粮食、饲料和加工用途的耕种和进口)的增长可以证明转基因作物不仅在农业、社会经济和环境方面均产生了良好收益，而且提高了食品安全水平、改善了营养水平[1]。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术作为常用于植物育种领域的技术，以其高效特异、可以同时沉默多个靶基因、不易产生抗性等优点为农业绿色发展提供了强有力的支撑。各个国家或地区对于RNAi转基因植物的监管评价均是在原有的转基因植物监管框架上进行的，但是由于RNAi转基因植物的分子特征等信息与传统的转基因植物存在一定的差异，因此，构建适用于RNAi转基因植物的安全评价指标和监管体系显得尤为必要。与此同时，由于RNAi的作用机制并未完全明确，因此将RNAi技术应用于改良育种还有相应的问题亟待解决。本文从转基因植物的监管现状出发，阐述了转基因植物主要种植国家或地区对转基因植物的监管政策，以便我国政府和相关科研人员完善RNAi转基因植物安全评价体系和相关政策，同时，提出了RNAi技术应用于改良育种过程中可能面临的问题和原因，并在现有研究的基础上提出可能的解决方法，以期助力RNAi技术的应用推广。

1 RNAi转基因植物的监管现状

随着新型育种技术的发展，一些基于RNAi技术的新产品已经问世。在此之前，不同国家或地区的法规对“基因修饰”概念存在较大差异，因而拥有不同的监管思路和评价体系。目前，国际上对基因修饰生物(genetically modified organism，GMO)的监管模式主要分为2大类[2]：一类是过程监管，以欧盟为代表的过程监管模式，他们认为重组DNA技术本身具有潜在风险，因此，只要是通过重组DNA技术获得的生物技术产品，均需接受安全性评价与监控；另一类是以美国为代表的产品监管模式，他们认为本质上，转基因生物与非转基因生物没有区别，监控管理的对象是基因修饰产品，而并非生物技术本身。总体而言，过程监管模式更为严格[3]。

辛普劳(J. R. Simplot)公司于2013年10月份针对其开发的基于RNAi技术的W8马铃薯在美国提出商业化申请。这是全球范围内提出商业化批准的首例基于RNAi技术的转基因品系。申报文件显示，该公司对W8进行了细致的环境安全、生态安全、食用安全以及分子特征信息的评价，采用的安全评价流程与传统转基因作物基本一致。美国通过研发人员和政府主管部门之间相互咨询协作的方法，以个案分析为原则，由美国农业部(United States Department of Agriculture，USDA)、食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)及环境保护署(Environmental Protection Agency，EPA)3个机构联合监管RNAi转基因产品。其中，USDA负责审查是否存在潜在的植物有害化风险，如果RNAi转基因产品不包含使植物有害化序列，则是否应用了农杆菌转化等均不受USDA监管；FDA的立场是基于咨询，具有市场化监管职能；EPA对赋予植物杀虫活性或抗病性的RNAi转基因产品基于个案进行评估，如RNAi干扰棉酚合成的棉花TAM66274[4]和RNAi干扰木质素合成的苜蓿KK179[5]。但美国FDA和EPA对RNAi转基因产品监管尚未给出正式意见。对待转基因作物态度最为谨慎的国家或地区之一就是欧盟，其标识阈值为0.9%。欧盟对于转基因作物严谨的态度从其转基因成分标识制度和作物批准流程中都能得到体现[6-7]。目前，对于已经在美国获批的基于RNAi技术的转基因马铃薯W8品系以及转基因玉米MON87411品系，欧盟仍在审批过程中。总之，欧盟对于RNAi转基因产品保留着一贯严谨的态度。

《农业转基因生物安全管理条例》是我国转基因安全评价和相关监管工作的指导性文件。我国已经批准了干扰木质素合成的RNAi转基因苜蓿KK179的应用。此外，也有RNAi转基因植物提交了安全证书的申请，具有高油酸(gm-fad-2)性状的RNAi转基因大豆DP305423和高油酸(gm-fad-2)、除草剂抗性(cp4-epsps)复合性状的RNAi转基因大豆作为加工原料的生物安全证书正在审批中。目前我国按照《转基因植物安全评价指南》进行RNAi转基因植物的安全性评价，但实际适用的RNAi转基因植物的安全性评价内容和指标还需要进一步细化和完善。

2 RNAi转基因植物育种面临的挑战

2.1 脱靶效应

最初，基因沉默RNAi机制被认为是小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)与同源靶mRNA序列特异性识别从而引发切割降解的机制。然而有证据表明，siRNA并不总是靶向特定基因，当siRNA靶向非靶基因的mRNA时就会导致非特异性基因沉默[8-9]，这种现象被称为脱靶(off-target)。植物拟南芥和烟草在转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)中可能出现的脱靶效应已有报道[9]。脱靶可能是RNAi转基因植物潜在的生物安全性问题。从RNAi的发生机制和作用过程等方面分析脱靶发生的原因，可以总结为9个方面：①长的发夹RNA，即双链RNA(double strand RNA，dsRNA)，可以产生多样化的siRNA文库以发挥最优的沉默效应，但同时也会提高脱靶的可能性；②dsRNA的数量高于所需要的阈值越多，脱靶效应发生的可能性就越大；③由RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)介导的小RNA(small RNA，sRNA)或部分dsRNA的扩增可能产生次级dsRNA[10]，这对细胞内dsRNA的数量具有较大的影响；④在RNAi技术中需要使用强大的启动子来驱动发夹RNA(hairpin RNA，hpRNA)的产生，由于抑制了天然微小RNA(microRNA，miRNA)或siRNA的调节，可能有利于一种完全不同类型的脱靶效应；⑤触发序列，即与mRNA互补同源的触发序列，可能发生变化；⑥研究发现，21 nt沉默触发序列与内源性靶基因序列之间100%同源性的核苷酸延伸并不是引发基因沉默的绝对必要条件[9,11]；⑦通过计算机预测和计算发现3′端非翻译区的匹配更易引起非预期沉默[12]；⑧与动物[13]相比，植物可以容忍少量的错配，从而增加了脱靶的可能性；⑨siRNA是沉默特异性的最终决定因素。发生脱靶效应的途径和原因众多[14]，为了减少脱靶现象的发生，本文提出了以下5点建议：①将siRNA文库在基因组数据库中进行比对分析，并利用生物信息学的方法分析预测发生脱靶的可能性；②选择具有组织特异性和诱导型启动子的RNAi载体；③保持有效siRNA的最低数量；④验证靶基因沉默的特异性；⑤谨慎解释RNAi基因功能沉默和表型研究的结果。

2.2 RNAi沉默效率

影响RNAi效率的因素较多，最主要的因素不仅与siRNA自身结构有关，还与siRNA发挥作用的过程有关。首先，植物组织中dsRNA浓度对于发挥RNAi效应至关重要，必须有足够的dsRNA来触发足够强的RNAi反应。然而，在低浓度下，沉默效应的强度明显依赖于剂量，目前还无法预测dsRNA的最优浓度，因此需要通过实验来确定。其次，植物产生的dsRNA片段的序列和长度也对RNAi效率具有一定的影响。如在果蝇细胞中，dsRNA有效诱导RNAi的最小长度要求为21 bp[15]。再者，dsRNA或者siRNA的稳定性对RNAi的反应具有较大影响，dsRNA在发挥作用前降解必然导致沉默失效。此外，靶标选择具有物种特异性，一个合适的靶标mRNA在另一个物种中未必是最合适的靶标。如对于RNAi抗虫作物来说，影响昆虫RNA干扰效率的因素与细胞摄取dsRNA的能力有关。dsRNA的主要接触途径是口服，dsRNA必须进入靶标昆虫的细胞，使dsRNA与RNAi途径关联，从而产生下游效应[16]。提高RNAi沉默效率的方法，除了深入了解各物种不同靶标的最适dsRNA设计，还要预测靶标合适靶点和脱靶的可能性，优化dsRNA转化途径和方法，必要时可以考虑同时沉默家族基因多个靶标以提高沉默效率。

2.3 抗性问题

RNAi转基因植物的抗性问题主要集中于有害生物抗性，如抗病毒、抗虫等。转基因作物被靶标害虫长期食用后，在作物的相应靶标生物种群中可能产生抗性从而导致作物抗虫的持久性降低[17-19]。理论上应考虑3个可能产生抗性的因素。首先，突变使昆虫的RNAi机制失活(或使其效率低下)，从而导致外源扩增的dsRNA无效[20]。然而，考虑到RNAi机制在昆虫发育和生理中所具有的基本功能(因为它在RNA代谢和sRNA生成过程中起着多种重要作用)，使RNAi机制失活的突变很可能与昆虫的适应能力和生存能力不兼容。RNAi机制中高度保守的缺失突变似乎不是害虫对环境RNAi的抗药性来源。其次，抗性可能是由于靶基因序列中突变的积累而引起的。从理论上讲，足够数量的点突变(或少量缺失)可将靶基因与dsRNA之间的同源性降低到由dsRNA生成的siRNA不再有效识别靶基因mRNA的程度。然而，鉴于在植物中表达的dsRNA的长度普遍有几百个碱基甚至更长，所以不太可能在合理的时间范围内积累足够多的突变使靶基因mRNA不受影响，同时序列的激烈变化仍能够与基因功能相兼容。一般情况下，一个必需基因被靶向，即使某个靶标基因积累了多个突变而对植物产生的dsRNA不再敏感，仍然可以利用不同的必需基因来解决由单一必需基因突变累积产生的抗性问题。考虑到昆虫基因组上存在大量必需基因，即使并非所有必需基因都适合作为RNAi的靶点，这些大量的必需基因也不会成为限制。此外，阻碍基因突变以助力抗性发展的简单策略就是同时靶向多个必需基因，即在相同的植物中表达2个不同的转基因dsRNA，或者产生1个长的嵌合dsRNA，包括2个或者更多靶基因序列[21]。最后，昆虫可能会对RNAi产生抵抗力，因为这些突变会影响消化道摄入dsRNAs的稳定性和/或肠道细胞的吸收能力[22]。RNAi在不同的昆虫种类中效率差别较大，虽然很多机制不明确，但是也可能是抗性进化的来源之一[23]。

2.4 跨界调控

siRNA分子在生物体中的迁移是一种普遍的现象，它促进了细胞和组织之间的基因沉默。siRNA信号也在同一物种不同种类的生物体之间传输。这些生物可能发生在同一物种中，如母乳喂养婴儿发生RNA介导的基因调控[24]；或者发生在不同物种之间，如寄生生物和寄主植物[25]。动物和植物交换siRNA也被发现与致病性、寄生性或共生生物体密切相关[26]。此外，RNA沉默信号的跨界运动还有从细菌到线虫，从植物到病原和共生微生物，从植物到线虫，从真菌病原体到植物，从植物到昆虫等[27]。这些跨物种调控的现象有时对于生物体疾病抗性方面发挥积极作用，但是跨物种调控如果发生在人体，并发挥负面调控作用，将会给人类和其他生物带来麻烦。Zhang等[28]在中国人的血液中检测到了植物来源并调控人类基因的miRNA。因此，dsRNA或者siRNA的跨物种调控可能是RNAi应用于植物生物技术育种的一个潜在生物安全性问题，关系着人类的食品安全、身体健康和其他物种的生态平衡。但是这些跨界沉默现象的许多方面仍需深入研究，包括如何选择特定的siRNAs进行传输，siRNAs如何在细胞外运输、识别并进入其目标细胞，以及这些siRNAs如何使用目标细胞的RNAi机制来传递沉默效应的模式。

3 展望

2001年，RNAi技术应用于哺乳动物细胞的基因功能研究[29]，开创了高等生物基因功能研究的先河，随后被广泛应用于农业、医疗等领域。RNAi技术应用于植物育种改良领域得到了较好的成果，但其应用潜力有待于进一步挖掘。由于目前尚未完全明确RNAi的作用机制，尤其是在植物中的作用过程和参与相应过程的蛋白，使得目前应用RNAi技术进行植物育种仍然面临一些挑战[30]。未来基于RNAi技术的转基因植物改良育种应注重减少脱靶效应、提高沉默效率、防止抗性产生，并进一步明确sRNA的跨界调控机理。除此之外，为了守护国门生物安全，更好地利用生物技术产品并推动农业育种和基础研究的发展，针对目前RNAi的研究现状，应加快建立科学全面的安全评价体系，完善基于RNAi技术的转基因植物的监管政策，规范RNAi育种作物的上市前风险评估，对市场应用RNAi产品进行严格标准的监测和评价，最大程度地发挥RNAi技术在植物育种中的应用，造福社会。