肿瘤相关基因甲基化检测试剂临床前研究要点

包雯

国家药品监督管理局 医疗器械技术审评中心，北京 100081

我国体外诊断产业正处于蓬勃发展的阶段，新的产品层出不穷，尤其是用于恶性疾病辅助诊断的试剂，其主要类别之一为肿瘤相关基因甲基化检测试剂。已上市的产品积累了一定的技术基础，但尚存在性能验证不充分的问题。如何在符合我国国情的前提下，指导企业科学合理地开展肿瘤相关基因甲基化检测试剂的性能评价，从而加速相关产品的注册申报，成为亟待解决的问题。这就要求企业不仅应重视临床试验的开展，也须系统而全面地进行临床前性能的研究，以综合评价产品的安全有效性。

临床前研究指的是从产品原材料的选择、反应体系的确认、企业参考品的设置、生产工艺的研究到产品分析性能评估，以及阳性判断值的确定的阶段。本文结合作者的工作经验，阐述了肿瘤相关基因甲基化检测试剂的技术审评关注点。旨在通过梳理企业在产品研发过程中面临的共性问题，指导相关产品的注册申报，其他一般性要求可参照相关的规范性文件。需要注意的是，企业应使用在有效运行的生产质量管理体系下生产的多批产品进行分析性能评估，以及确定阳性判断值。

此外，有效评价体外诊断试剂的分析性能，正确确定阳性判断值，将会大幅提高临床评价指标满足验收标准的概率，反之可能对临床试验结果（如灵敏度和特异性）造成不利影响。

1 肿瘤相关基因甲基化检测试剂的背景

人类基因组DNA的甲基化目前发现存在于“CG”二核苷酸中的胞嘧啶碱基（C）上，是人类的表观遗传修饰方式之一，能够调节基因的表达。基因启动子区CpG岛的甲基化通常被认为是基因表达降低甚至沉默的标志。正常人群中的抑癌基因启动子区CpG岛一般为低甲基化状态，当其发生异常高甲基化时，将会使细胞逃逸凋亡、DNA修复缺陷、血管生成或发生黏附功能缺失等。于是，特定基因DNA甲基化水平和模式的改变与肿瘤的发生密切相关[1]。例如，相对于正常结直肠组织，SDC2基因在不同分期的结直肠癌和部分进展期腺瘤组织中呈高水平甲基化状态，提示对其进行检测具有辅助诊断结直肠癌和进展性腺瘤的临床应用价值[2-3]。另外，美国FDA已批准KRAS基因突变、BMP3/NDRG4基因甲基化和便隐血联合检测试剂，用于50岁及以上典型平均风险的结直肠癌患者筛查，但不能替代高风险人群的结直肠镜检查。

甲基化试剂的研发分为临床前研究和临床试验两个阶段。我国已有Septin9和SDC2基因甲基化检测试剂盒等数个产品上市，用于结直肠癌的辅助诊断。目前有多个产品正在注册申报过程中，通过联合检测多个基因的甲基化状态，用于结直肠癌、肝癌、宫颈癌等的辅助诊断。该类产品一般基于实时荧光定量PCR技术，检测粪便、血液或组织样本中肿瘤相关基因的甲基化状态。预期用途为结合影像学、病理学等其他检测手段，用于对有相关适应症疑似症状患者的辅助诊断。其检测结果仅供临床医生参考，不作为肿瘤早期诊断或确诊的依据，临床医生应结合患者病情及其他检测指标进行综合判断。

2 肿瘤相关基因甲基化检测试剂企业参考品的设置

此类产品目前尚无适用的国家参考品，企业应在保证产品原材料和生产工艺稳定可靠的基础上，科学合理地设置企业参考品，并相应地进行产品性能验证以及后续的产品检验。

阳性参考品考虑检出能力的验证，建议设置为不同浓度水平的相关适应症患者样本或标准细胞系。阴性参考品则考虑检测特异性的评价，可为其他相关肿瘤类型的患者样本、其他基因甲基化的样本或标准细胞系等。精密度参考品包含中等强度阳性、弱阳性和阴性水平样本。检出限参考品包含不同背景核酸浓度下、目标基因不同甲基化比例的样本；可采用临床样本或细胞系，基质建议使用临床阴性样本。注意，不建议采用亚硫酸盐转化的DNA（bisDNA）作为企业参考品的原料。

3 肿瘤相关基因甲基化检测试剂反应体系的研究

3.1 样本要求

对样本采集与处理的过程进行充分研究，包括样本采集方法、原始样本用量和核酸用量等。建议纳入数十例临床样本，充分评价样本采集、核酸提取和转化过程的精密度。

3.2 核酸提取、转化和纯化环节的性能

首先评价核酸提取试剂的提取效率、浓度和纯度。另外对甲基化转化过程进行研究，即转化能力的评价，包括核酸回收率、转化效率和保护效率。建议与焦磷酸测序或其他商业化转化试剂盒进行比较。

注意，须采用临床真实样本充分评价转化前后DNA的含量、内参基因的量值、各个基因的甲基化状态以及比例等。

4 肿瘤相关基因甲基化检测试剂的分析性能评估[4]

体外诊断试剂的通用要求是由相关企业在主要原材料和反应体系经过确认、生产工艺得到有效控制并且保证产品质量稳定的基础上，制订方案并相应地开展研究。试验人员应经过必要的培训，熟悉检测系统的操作程序、样本制备方式和试验方案，严格执行校准和质量控制方法。在对结果进行数据检查后，选择适当的统计方法进行分析，并形成研究报告。

以下阐述了肿瘤相关基因甲基化检测试剂的具体评价内容，包括推荐的研究方法以及采用的样本类型。

4.1 测量准确度（accuracy of measurement）[5-7]

测量准确度包括正确度和精密度，受系统误差和随机误差共同影响。建议综合考虑不精密度和偏倚的影响，首选采用总分析误差较小的对比方法进行比较研究。

4.1.1 正确度（trueness） 首选采用与临床诊断结果进行比较研究的方式，评价试剂的诊断灵敏度。或采用与已上市同类产品进行方法学比较研究的方式，通过计算阴阳性符合率和总符合率，评价试剂与同类产品的一致性。如无同类产品，也可采用核酸序列测定方法，如高通量测序或数字PCR法等。

建议使用临床真实样本，纳入不同分期的相关肿瘤适应症样本进行符合性研究，另外纳入其他易转移至原发肿瘤部位的癌症类型、肿瘤部位的其他良性疾病、其他相关肿瘤类型的患者样本对试剂进行特异性评价。

样本可为有明确诊断结果的患者样本或者参考样本盘等。

4.1.2 精密度（precision） 即重复性、中间精密度和重现性，主要变量包括操作者、仪器、运行、试剂批次、校准品批次、校准周期、时间、地点等。

建议使用临床样本进行评价，包括阴性、弱阳性以及中等阳性水平的样本。

4.2 分析灵敏度（analytical sensitivity）[8]

对于定性检测试剂而言即为最低检测限。选取特定浓度的阳性样本梯度稀释进行最低检测限的确定。建议设置多个浓度梯度，每个浓度重复检测不少于3次，以100%可检出的最低浓度水平作为预设检测限。在此浓度附近制备若干浓度梯度样品，每个浓度至少重复检测20次，将具有95%阳性检出率的最低浓度作为最低检测限。建议使用临床阴性样本作为基质，充分评价在不同DNA浓度下，试剂对于不同甲基化比例目标基因的检出能力。

样本可为标准细胞系或特定浓度的临床阳性样本。注意应对其甲基化状态进行确认，可采用进行甲基化转化后测序，验证甲基化序列位点的方法。

4.3 分析特异性（analytic specificity）

4.3.1 交叉反应（cross reactivity） 包括具有同源性序列的核酸片段、其他基因甲基化样本等。

4.3.2 干扰物质（interference）[9]包括血红蛋白、脂质、胆红素、自身免疫抗体、常用药物及其代谢物、患者使用的治疗药物、抗凝剂和已有报道的干扰物质等。

建议对样本中可能存在的内源性及外源性干扰物质进行研究。具体方法为使用多份弱阳性、阳性的临床样本，分别添加医学决定水平浓度的干扰物质（建议为可能存在的最高浓度水平），每个样本重复检测不少于3次，评价待测物的回收率，确定是否产生干扰。

5 肿瘤相关基因甲基化检测试剂阳性判断值的确定[10-11]

阳性判断值在鉴别良性与恶性疾病、确定疾病进程等方面具有重要意义。正确制定阳性判断值能够充分体现试剂的临床性能，如诊断准确性等。下述内容包括推荐的研究方案以及采用的样本类型。

对于包含多个肿瘤相关基因甲基化的检测试剂，可分别确定不同单个目标基因和内参基因Ct值的差值或拷贝数的比值，判定检测结果的阴阳性。在此基础上，采用逻辑回归模型分析，初步建立公式，具体为赋予各个自变量（ΔCt值）不同的回归系数并计算总体分值，以达到与诊断结果一致性最佳的目的。再根据上述分值进行ROC曲线分析，选择约登指数最大值点或者平衡临床性能最优的灵敏度和特异性界值，从而确定试剂的阳性判断值。其量值单位可为ΔCt值或者分值。

阳性判断值的确定过程包括建立与确认两个阶段。建议区分训练集和验证集，分别纳入不同的样本子集，以保证算法模型的可靠性。注意采用临床真实样本进行研究，应来源于试剂预期的适用人群以及相关适应症并充分覆盖不同的亚组。样本总数量可为数百例。

另外，考虑到确定阳性判断值时使用的样本对于目标人群的代表性有限，建议通过临床试验进一步确认阳性判断值的准确性。

6 结语

随着肿瘤相关基因甲基化检测试剂的涌现，针对产品设计开发过程中存在的技术难点以及合规性问题，必要的解决手段之一是指导企业如何规范地开展临床前研究，不但能够提高临床试验成功的可能性，并且有助于后续产品注册的顺利进行。

本文结合国际通用注册申报规范性文件、相关技术指南等，对肿瘤相关基因甲基化检测试剂反应体系研究、分析性能评估以及阳性判断值确定的关键要素进行了初步探讨，期望有助于相关企业更具针对性地进行相关试剂的临床前研究，相应地大幅提高产品的注册申报效率。此外，期待与各方协作探索更加优化的评价方法，共同努力提升研究质量。