鲜竹沥化学成分及抗炎活性研究

谭洋，刘良玉，游媛，姚金龙，林凯鹏，付辉政,，罗跃华*

1.中国医药工业研究总院，上海 201203；2.江西省药品检验检测研究院，国家药监局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，南昌 330029；3.江西省药品检查员中心，南昌 330029

鲜竹沥为禾本科植物粉绿竹Phyllostachys viridiglaucescens（Carr.）A.et C.Riv.、净竹P.nudaMcClure、毛竹P.edulis（Carr.）J.Houz.及其同属植物的新鲜杆茎经加热后自然沥出的液体，煮沸加入适量防腐剂即得，其亦可称为竹油、竹醋液和竹汁［1,2］。具有清热化痰的功效，临床上用于治疗肺热咳嗽痰多、气喘胸闷、小儿痰热惊风等病症。《本草衍义》称之为“痰家之圣剂”。其主要含有愈创木酚、氨基酸、无机元素、酚酸、黄酮、糖类等成分［3-5］。目前，鲜竹沥执行的标准为1992年版《卫生部药品标准》第一册，该标准项下的检测项目包括性状、薄层鉴别和3个理化检查项［1］，标准较低，加之其加工工艺参数不明确，难以有效控制产品质量，鲜竹沥也是2019年度国家药品标准提高起草品种。然而，目前对于鲜竹沥药效物质研究报道较少，已报道的化学成分主要是通过理化分析确定的大类成分，其药效物质基础及质量标志物尚不明确，为了制定更加科学合理的质量标准以及充分挖掘该资源，作者在项目组前期化学成分研究基础上［6,7］，继续利用各种色谱、波谱技术从鲜竹沥乙酸乙酯部位中分离鉴定了4个化合物，分别为1、（7S,8S）-5'-甲氧基-2,3,4,9-四羟基-3':7,4':8-二环氧新木脂素-1'-羧酸甲酯；2、紫菀苷A；3、（+）-ovafolinin B-9′-O-β-D-glucopyranoside；4、苯丙酮 4′-O-茜黄樱草糖甙。其中化合物1是新化合物，化合物2～4是首次从鲜竹沥中分离得到的化合物；体外活性检测表明，化合物1具有抗炎活性，能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO、TNF-α 和IL-6的释放。

1 仪器与试药

1.1 仪器岛津20-AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；岛津20-AR型半制备色谱仪（日本岛津公司）；Buchi中压制备色谱仪（瑞士Buchi公司）；EYELA SB-1000旋转蒸发仪（日本EYELA公司）；UV-260紫外分光光度仪（日本岛津公司）；WZZZB旋光仪（上海物理光学仪器厂）；XT5B熔点仪（天津天光光学仪器有限公司）；Bruker DRX-400超导核磁共振仪（德国Bruker公司）；Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 Q TOF高分辨质谱仪（美国沃特世公司）；多功能微孔板检测仪（BIOTEK，型号：synergy2）；二氧化碳恒温培养箱（Thermo，型号：Series 8000DH）。

1.2 试验材料与试剂水为Milli-Q超纯水，CD3OD和DMSO-d6为美国剑桥公司产品，色谱用试剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯。毛竹采自江西铜鼓，经江西省林业科学院余林博士鉴定为禾本科刚竹属植物毛竹P.edulis（Carr.）J.Houz.的新鲜杆茎。标本现存放在江西省药品检验检测研究院中药标本馆。C18填料为日本YMC产品，制备色谱柱为YMC（5 μm，250 mm×20 mm）；柱层层析硅胶、薄层硅胶G板（青岛海洋化工厂）；RAW264.7细胞（中科院上海细胞库）；LPS试剂（美国Sigma公司）；胎牛血清（Gibco公司，批号：2129075RP）；DMED高糖培养基（Cytiva公司，批号：AF29561079）；NO测试盒（碧云天生物研究所，批号：042318180614）；TNF-α（批号：8G319X）和IL-6 ELISA（批号：8G319X）试剂盒为武汉Elabscience公司产品。

2 方法与结果

2.1 提取和制备方法取新鲜毛竹杆茎（10 t），经切断、开片、加热干馏、收集等多种工艺得到鲜竹沥原液，鲜竹沥原液经低温减压浓缩至相对密度为1.21，得到鲜竹沥浸膏。取浸膏，依次用乙酸乙酯和正丁醇进行提取，每种溶剂各提取4次，合并每种溶剂提取液。再进一步对得到的溶剂提取液进行低温减压浓缩，得到乙酸乙酯干膏305 g和正丁醇干膏852 g。将乙酸乙酯干膏经硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇（10∶1～6∶4）进行梯度洗脱，薄层色谱检视合并得到9个组分Fr.1～Fr.9。Fr.1（111.9 g）通过硅胶柱分离，以氯仿-甲醇（80∶1～20∶1）梯度洗脱，薄层色谱检视合并得11个组分Fr.1-1～Fr.1-11。Fr.1-9（3.3 g）再经过中压液相制备色谱，以甲醇-水（20∶80～60∶40）梯度洗脱，经高效液相色谱检测合并得到12个组分Fr.1-9-1～Fr.1-9-12。Fr.1-9-2（68.8 mg）经反相半制备液相色谱，甲醇-0.02%三氟乙酸（30∶70）（7 mL/min）为流动相，得化合物1（40.6 mg，tR=85.2 min）。Fr.1-9-4（35.2 mg）经反相半制备液相色谱，以甲醇-水（25∶78）（7 mL/min）为流动相，得到化合物2（7.5 mg，tR=92.3 min）、3（9.7 mg，tR=110.8 min）和4（4.1 mg，tR=123.4 min）。

2.2 体外抗炎活性实验方法将对数期生长的RAW264.7细胞（细胞浓度为5×105个/mL）接种于24孔板中，每孔500 μL，于培养箱中孵育24 h后弃上清液，试验分为正常对照组、模型组和鲜竹沥A给药组。每组6个复孔，对照组和模型组均加入10%胎牛血清DMEM高糖培养基，给药组分别加入药物终浓度为0.1、1、10 μmol/L的完全培养基，培养箱中孵育4 h后，模型组和给药组分别加入终浓度为2 μg/mL的LPS溶液，继续放入培养箱中培养，24 h后，吸取上清，按照试剂盒说明书检测上清中NO的含量，平行试验重复3次。

将对数期生长的RAW264.7细胞（细胞浓度为5×105个/mL）接种于24孔板中，每孔500 μL，于培养箱中孵育24 h后弃上清液，试验分为正常对照组、模型组和鲜竹沥A给药组。每组6个复孔，对照组和模型组均加入无血清培养基，给药组分别加入药物终浓度为0.1、1、10 μmol/L的无血清培养基，培养箱中孵育4 h后，模型组和给药组分别加入终浓度为2 μg/mL的LPS溶液，继续放入培养箱中培养，24 h后，吸取上清，按ELISA试剂盒说明书步骤检测上清中TNF-α 和IL-6含量，平行试验重复3次。

2.3 化学成分鉴定化合物1：白色粉末。mp 166～167 ℃；。紫外光谱（UV）数据表明该化合物在甲醇溶液中于279 nm处有最大吸收。红外光谱（IR）显示有羟基（3 319 cm-1）和苯环（1 448 cm-1）的吸收。HR-ESI-Q-TOF-MS质谱给出准分子离子峰（m/z）：401.121 4［M+Na］+（计算值为401.120 7），分子式为C18H18O9。

1H-NMR谱中，显示了一组AB邻位偶合系统苯环质子信号δH：7.24（1H，d，J=8.4 Hz），6.73（1H，d，J=8.4 Hz）；一组间位偶合苯环质子信号δH：7.34 （2H，brd）；两个甲氧基信号δH：3.89（6H，s）；此外，根据TCOSY谱，1H-NMR谱还显示一组脂肪族质子信号δH：5.00（1H，d，J=6.6 Hz），4.27（1H，m），3.76（1H，dd，J=12.0，3.6 Hz）和3.65（1H，overlap）。13C-NMR谱中，给出了18个碳信号，其中1个酯羰基碳信号δC：168.2；12个苯环碳信号δC：158.2，154.3，142.1，132.7，129.4，126.8，116.0，108.3，108.2；3个与氧连接的碳信号δC：89.0，74.3，62.1；2个甲氧基碳信号δC：56.9，52.9。通过以上数据可以推测化合物1为木脂素类化合物，与文献［8］所报道的3-（4-Hydroxy-3-methoxyphenyl）-2-hydroxymethyl-8-methoxy-2,3-dihydrobenzo［1,4］oxine-6-carbaldehyde结构比较，多一个羟基，醛基由羧基甲酯代替。

在HMBC中（图1），H-2' （δH7.34）和H-6' （δH7.34）与羰基碳（δC168.2）相关，表明羰基碳连接在C-1' 位。OMe-5'（δH3.89）与C-5'（δC154.3）和OMe-7' （δH3.89）与C-7'（δC168.2）相关联，说明2个甲氧基分别位于C-5'和C-7'位。另外，H-7（δH5.00）与C-1（δC129.4），C-2（δC158.2），C-6（δC129.4），C-8（δC89.0）相关，表明C-7与C-1相连。

根据H-7和H-8的耦合常数JH-7,H-8=6.6 Hz，推测H-7和H-8的相对构型为反式［9］。在NOESY谱中，H-7与H-9相关，而H-7与H-8无关联，说明H-7和H-8所处的位置为反式。在CD谱中，217 nm处可见正Cotton效应（Δε217nm=+9.5），273 nm处显示负Cotton效应（Δε273nm=-7.5），由此确定该化合物7,8位的绝对构型为7S，8S［10］。

综上所述，化合物1结构鉴定为（7S，8S）-5'-甲氧基-2，3，4，9-四羟基-3':7，4':8-二环氧新木脂素-1'-羧酸甲酯，结构如图1所示。具体核磁数据见表1。

表1 化合物1的1H-NMR and 13C-NMR波谱数据（600/150 MHz，CD3OD）

（续表）

化合物2：淡黄色粉末（甲醇）。HR-ESI-MS（m/z）：453 ［M+Na］+，429 ［M -H］-，1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：2.51（3H，s，H-8），4.16（1H，d，J=8.0 Hz，木糖-H-1″），4.93（1H，d，J=8.0 Hz，葡萄糖-H-1′），7.17（2H，d，J=8.6 Hz，H-3,5），7.94（2H，d，J=8.6 Hz，H-2,6）；13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：130.7（C-1），130.0（C-2，6），116.1（C-3，5），161.1（C-4），199.0（C-7），30.9（C-8），99.8（C-1′），73.0（C-2′），76.4（C-3′），69.3（C-4′），76.1（C-5′），68.2（C-6′），103.9（C-1″），73.0（C-2″），76.1（C-3″），69.5（C-4″），65.6（C-5″）。上述数据与文献［11］报道的数据基本吻合，所以鉴定化合物2为紫菀苷A。

化合物3：淡黄色粉末（甲醇）。HR-ESI-MS（m/z）：602 ［M+Na］+，578［M -H］-，1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：2.35（1H，d，J=7.6 Hz，H-8′），2.41（1H，m，H-8），2.93（1H，d，J=16.7 Hz，H-7′b），3.13（1H，dd，J=16.8，7.6 Hz，H-7′a），3.31（3H，s，3′-OMe），3.71（3H，s，4-OMe），3.70（1H，dd，J=11.2，6.0Hz，H-9b），3.78（3H，s，5′-OMe），3.87（1H，m，H-9′b），3.89（3H，s，2-OMe），3.98（1H，d，J=8.7 Hz，H-9a），4.33（1H，d，J=8.0 Hz，Glc-H-1″），4.46（2H，dd，J=11.8，4.2 Hz，H-9′a），4.79（1H，s，H-7），6.33（1H，s，H-5），6.54（1H，s，H-6′）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：125.7（C-1），146.9（C-2），136.8（C-3），147.8（C-4），102.4（C-5），154.1（C-6），31.5（C-7），42.4（C-8），73.6（C-9），127.5（C-1′），124.2 （C-2′），147.5（C-3′），138.4（C-4′），148.6（C-5′），107.5（C-6′），30.3（C-7′），35.7（C-8′），81.5（C-9′），104.8（C-1″），75.5（C-2″），78.2（C-3″），71.4（C-4″），77.8（C-5″），62.5（C-6″），62.1（3-OCH3），56.6（4-OCH3），60.1（3′-OCH3），56.5（3′-OCH3）。上述数据与文献［12］报道的数据基本吻合，所以鉴定化合物3为（+）-ovafolinin B-9′-O-β-D-glucopyranoside。

化合物4：棕色粉末（甲醇）。HR-ESI-MSm/z：467 ［M+Na］+，443 ［M-H］-，1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：1.19（3H，t，J=7.8 Hz，H-9），3.04（2H，m，H-8），3.76（1H，m，H-6'b），4.11（1H，dd，J=12.0，2.0 Hz，H-6'a），4.33（1H，d，J=8.0 Hz，木糖-H-1''），4.98（1H，d，J=8.0 Hz，葡萄糖-H-1'），7.21（2H，d，J=8.6 Hz，H-3，5），7.99（2H，d，J=8.6 Hz，H-2，6）；13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：132.4（C-1），131.4（C-2），117.3（C-3），162.7（C-4），117.3（C-5），131.4（C-6），202.1（C-7），32.4（C-8），8.7（C-9），101.5（C-1′），74.8（C-2′），77.7（C-3′），71.4（C-4′），77.8（C-5′），69.8（C-6′），105.4（C-1″），75.1（C-2″），77.9（C-3″），71.3（C-4″），66.8（C-5″）。上述数据与文献［13］报道的数据基本吻合，所以鉴定化合物4为苯丙酮 4′-O-茜黄樱草糖甙。

2.4 抗炎活性药理活性测试发现，与正常对照组比较，LPS显著增加RAW264.7细胞NO、TNF-α和IL-6的释放，均具有显著性差异（P＜0.001）（见表2）。化合物1能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO、TNF-α 和IL-6的释放；其他化合物均无显著的抗炎活性。

表2 化合物1对LPS刺激RAW264.7细胞炎症因子分泌的影响（，n=6）

表2 化合物1对LPS刺激RAW264.7细胞炎症因子分泌的影响（，n=6）

注：与正常对照组比较，***P＜0.001；与模型组比较，#P＜0.05、##P＜0.01，###P＜0.001。

3 讨论

鲜竹沥是具有传统工艺炮制（火炙法）特色的一味止咳祛痰中药，疗效确切。本课题组对鲜竹沥化学成分进行系统性研究，首次从鲜竹沥中获得2个木质素类化合物和2个酚糖苷类化合物，其中化合物1为首次发现的新化合物，且具有良好的抗炎活性，能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO、TNF-α 和IL-6的释放，为阐明鲜竹沥镇咳祛痰药效奠定了物质基础，同时为鲜竹沥进一步开发利用提供了科学依据。