肉类微生物多样性分析方法的研究进展

甄宗圆，胡雪洁，徐留艳，王艺霖，牛玺程

(1.安徽科技学院 食品工程学院，安徽 滁州 233100； 2.枣庄学院 食品科学与制药工程学院，山东 枣庄 277160； 3.南昌大学 南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047)

肉及肉制品中的微生物来源广泛，种类繁多，包括细菌、真菌和病毒等。所谓微生物多样性，是指一个集合群落中，众多不同类型微生物的变化以及它们之间相对的丰度[1]。在发酵肉制品中，由于微生物的作用,肉制品中的大分子物质被降解，使发酵肉制品营养物质更易被吸收,且蛋白质和脂肪适度水解氧化呈现出特殊发酵风味[2]。我国肉产业已连续20年稳居世界第一，肉类产量呈总体上升趋势[3]。由微生物引起的腐败变质造成的经济损失巨大，而且被致病性微生物污染的肉及肉制品会对消费者的健康造成威胁。因此，研究肉及肉制品微生物多样性在特定腐败菌抑制技术研究、保障肉类产品品质和消费者安全等方面意义重大。本文中，笔者对肉类微生物多样性分析方法进行综述，为开展肉类微生物多样性研究提供技术资料。

1 肉及肉制品中微生物的来源

对健康的动物来说，屠宰时肌肉组织内部几乎是无菌的。但是，屠宰后的鲜肉却或多或少地含有多种微生物，造成这种微生物污染的原因一般认为有两个方面，即内源性污染和外源性污染[4]。内源性污染是指来自动物体内的微生物造成的污染。在活的动物体内，淋巴结、呼吸道和肠道等部位均含有大量微生物。在屠宰动物时，这些微生物都有可能越过组织屏障进入肌肉组织内部造成污染。外源性污染是指动物在屠宰、加工、运输直到消费的整个过程中，由于用具、操作人员和环境的不洁等因素造成的微生物污染。外源性污染是肉类微生物污染的主要来源。肉品被微生物污染后引起的食源性疾病和食品腐败变质是影响食品安全的最主要因素。此外，在发酵肉制品中为了确保产品的风味特色、质量，缩短生产周期，也会采用人工接种的方法。

2 肉类微生物多样性分析方法

2.1 传统方法

传统的微生物分析方法依赖于培养基的培养、分离和鉴定，根据微生物的形态特征、生理生化反应特征、生态学特征以及血清学反应等作为鉴定依据，是过去进行微生物分析的唯一途径。传统培养方法多用于研究自然或人为因素对肉类微生物多样性的影响[5]，Pereira等[6]采用选择性培养基，结合必要的生理生化反应的方法，对冷藏条件下不同包装形式的兔胴体取样，进行中温好氧菌、嗜冷好氧菌、假单胞菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌和肠杆菌科的培养分离和菌落计数，以确定不同包装形式的优势菌，并以106cfu/g作为可接受限度，判定不同包装形式兔胴体的货架期。Rodríguez-Calleja等[7]也采用传统微生物培养的方法，研究在(3±1) ℃有氧储存期间兔胴体微生物种类和丰度变化，发现当需氧菌、嗜冷菌和假单胞菌的平均数量为108cfu/g左右时，胴体开始腐败，货架期被评估为大约6.8 d。Lan等[8]也采用传统微生物培养的方法，使用平板计数琼脂分别对-4、-2.5和4 ℃温度下贮藏的伊拉兔胴体(雄)的菌落总数进行了测定，研究两种超冷温度对兔肉品质的影响。

传统培养方法在确定受自然和人为影响的环境中微生物群落结构方面是非常有用的[5]，然而，它们也有一定的局限性。例如，细菌在受到饥饿、温度骤变、压力、非最佳盐度和酸碱度等环境因素影响时，会失去生长的能力，转而进入一种活而不长(VNC)的状态[9]。在这种状态下，细菌的代谢活动和生长速率减慢，在常规的细菌培养基上不再能检测到它[10]，无法全面评估微生物群落的多样性。同时利用传统培养的方法进行细菌鉴定，研究微生物对肉类腐败的影响，只有不到1%的微生物可以被识别[11]。

2.2 分子生物学方法

随着现代分子生物学技术的快速发展，变性梯度凝胶电泳(DGGE)、实时荧光定量PCR(RT PCR)和高通量测序(HTS)已广泛应用于肉类微生物多样性的研究，为研究肉类微生物群落结构和功能基因组提供了新的方法。

2.2.1 DGGE在肉类微生物多样性研究中的应用

DGGE方法基于将16S rRNA特定区域进行聚合酶链式反应(PCR)，得到长度相同而碱基组成不同的片段，然后在凝胶中通过线性增加变性梯度，使不同序列的扩增产物分离。其原理是通过16S rRNA基因在含有梯度变性化合物配制的聚丙烯酰胺凝胶中的序列特异性融点不同实现的，部分解链的16S rRNA分子在凝胶中基本停止迁移，而完全螺旋形式的分子继续向前移动，这样不同的片段就被有效分离[12-13]。染色后，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以快速辨别出样品中微生物的种类和相对丰度，与GenBank中的标准序列比对可获得它们的遗传相关性[14]。

我国有多位学者应用此技术对肉类贮藏期间微生物多样性进行研究。任静等[15]应用PCR-DGGE 技术结合常规平板培养，对托盘包装和真空包装两种包装形式的调理预制烤猪肉在4 ℃贮藏期间微生物的生长特性进行研究，结果表明：托盘包装的样品在贮藏末期时的电泳条带明显比真空包装的样品更粗、更亮，表明真空包装的样品腐败菌数量少于托盘包装的样品，并提出平板培养结合PCR-DGGE方法可使调理预制烤猪肉冷藏过程中微生物生长特性的测定结果更为准确、全面。牟广磊[16]在提取不同处理组冷却牛肉中细菌总DNA后，对16S rRNA基因的V3可变区进行PCR-DGGE分析，结合割胶测序，分析图谱得到以下结果：在4 ℃贮藏条件下，图谱中条带种类和条带明亮程度都会随着时间的延长而发生比较明显的变化，说明在贮藏期间微生物群落的种类和丰度发生变化。

2.2.2 RT PCR在肉类微生物多样性研究中的应用

RT PCR定量检测是指向反应体系中加入荧光基团，在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱变化，实时监测特异性产物的量，最后通过标准曲线对目的基因进行定量分析的过程[17-18]。Rouger等[19]采用RT PCR技术对鸡腿菌群的DNA进行扩增，将其与16S rDNA焦磷酸测序得到的结果进行对比，最终确定热杀索丝菌(Brochothrixthermosphacta)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)和肉食杆菌属(Carnobacteriumsp.)为鸡腿的优势菌。该研究证实了RT PCR对目标微生物进行定量分析的优势。

2.2.3 HTS在肉类微生物多样性研究中的应用

HTS又称“第二代测序技术”或“深度测序技术”，是新兴发展起来的免培养分子生物学技术，依赖于对样本中存在的细菌16S rRNA、真菌18S rRNA或ITS(internal transcribed spacer)特定区域的部分扩增，可一次性对几十万到几百万条的DNA分子进行序列测定[20]，能够同时分析多个样品，被广泛应用在动态监测食品发酵过程中微生物多样性和群落结构组成的研究中。高通量测序技术分析食品微生物群落的主要操作流程包括：①样品中微生物总DNA或RNA提取；②引物选择和PCR扩增；③测序；④生物信息学分析，包括操作分类单元(OTU)聚类、物种分类和多样性分析[21]。

高通量测序主要包括ABI SOLiD连接酶测序、Roche 454 Life Sciences焦磷酸测序和Illumina Solexa聚合酶测序。在肉类产品微生物多样性研究中，广泛应用的是Roche 454 Life Sciences焦磷酸测序(特别是454 FLX技术)和Illumina Solexa聚合酶测序(特别是MiSeq技术)。近年来在发酵香肠微生物多样性研究中普遍使用Illumina Solexa聚合酶测序，如Quijada等[22]在Illumina MiSeq平台对莱昂香肠的原料肉及香肠发酵过程中微生物多样性进行了分析。Wang等[23]也利用HTS技术在Illumina MiSeq平台对萨拉米香肠的细菌和真菌生态系统进行了分析，细菌覆盖率在0.99以上，真菌覆盖率为0.96，说明大多数的微生物系统类型被检测到，并提出高通量测序是评价发酵香肠中微生物多样性和监测食源性病原体的有效工具。Wang等[24]在另一篇报道中首次通过高通量测序，在Illumina MiSeq平台研究了萨拉米香肠、中国干腌香肠和中国熏制香肠的细菌多样性和组成。这些技术是将片段化的基因进行接头连接形成单链，用不同的方式进行PCR扩增产生更多的单分子序列，随后通过引物杂交和酶的延伸实现序列的测定，检测每一步反应所产生的信号来获得测序数据，最后由计算机分析获得完整的序列信息[25-26]。由于各测序平台测序原理不同，所以在测序深度、读长、运行时间、错误类型以及测序成本等方面均有一定的差异。ABI SOLiD连接酶测序读长最短(50 bp)，但其创新之处在于双碱基编码的应用，极大地降低了测序的错误率，由于其双碱基编码和校正系统原理与重测序相似，因此该测序平台多应用于具有高质量参考基因序列物种的重测序，而很少应用于微生物生态学的研究[27]。Roche 454 Life Sciences焦磷酸测序的序列读长在3种测序平台中最大(600～1 000 bp)，但其测序通量最低(0.5～1.0 GB)、测序费用较高[28]。Illumina Solexa聚合酶测序平台目前主要有HiSeq技术和MiSeq技术[29]，尽管Illumina与454测序技术相比，读长短，但测序通量较高，且最新版本增加了读长和测序通量，在单次测序运行中能够完全分析数十个样品[30]，已广泛应用于发酵肉制品和调理肉制品微生物的研究(特别是MiSeq技术)，极大地改变了人们对肉类微生物学的认识，是评价肉类微生物多样性和监测食源性病原体的有效工具[11,19,23,31-33]。在未来几年HTS将可能有效地检测以前没有从食物中获取的物种，并且阐明其可能的功能和作用，但不是替代基于培养的方法。

HTS技术也被应用于分析肴肉、冷藏牛肉和法国鸡肉切片的微生物多样性。肖英[31]将传统细菌培养法与基于宏基因组学的焦磷酸测序技术相结合，对真空包装水晶肴肉在4 ℃、30 d贮藏期内微生物的多样性和动态变化进行研究，细菌纯培养的方法共分离鉴定出真空包装水晶肴肉在贮藏期内26个属的36种细菌，而焦磷酸测序法共鉴定出169个属的细菌，53 363个有效序列，能够提供关于细菌群落变化更丰富和更准确的数据。Zhang等[32]同样以真空包装的肴肉为研究对象，在Illumina平台DNA测序后评估微生物群落的多样性和相对丰度，最初，芽孢杆菌科(Bacillaceae)是最主要的类群，平均丰度为62.5%，随后，由于细菌间竞争导致的生长抑制，丰度急剧下降。肠杆菌科(E￣n￣t￣e￣r￣o￣b￣a￣c￣t￣e￣r￣i￣a￣c￣e￣a￣e)和莫拉氏菌科(Moraxellaceae)，除了0 d检出率都很高，在试验储存期结束时达到70.5%。肠杆菌科的相对丰度在整个实验储存期间持续增加，并且在22～30 d稳定，达到约45%的水平。上述结果表明，肴肉是肠杆菌科的良好基质，由此家族引起的污染是肴肉贮藏过程中的常见问题。Yang等[33]通过高通量测序评估了在改良气调包装(MAP)中冷藏牛排的微生物群落，测序数据经质量过滤，80% O2-MAP和CO-MAP的冷藏牛排分别获得38 490和38 474个优质序列，这些序列被分别聚类到681和716个不同的OTUs中；B.thermosphacta和Pseudomonasspp.是80%O2-MAP牛排的优势菌，假单胞菌属从第10天起逐渐超过前者，明串珠菌属(Leuconostoc)、乳酸菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、徘徊球菌属(Vagococcus)和沙雷氏菌属(Serratia)在CO-MAP牛排中交替占优势，乳球菌最终成为最常见的细菌。

3 各种分析方法的特点和比较分析

传统微生物分析方法存在一定的局限。如，细菌处在营养物质不足，非最佳温度、盐度和酸碱度的环境中时，会失去生长的能力，转而进入一种“viable but non-culturable”状态[9-10]。在这种状态下，细菌的代谢活动和生长速率减慢，在常规的培养基上不再能检测到，因此，无法全面评估微生物群落的多样性。也有研究表明利用传统方法进行细菌鉴定，只有不到1%的微生物可以被识别[34]。

分子生物学方法的兴起，克服了传统培养的缺点，使微生物多样性分析取得长足的进步。PCR-DGGE技术因不依赖于常规培养，检测极限低，能检测到难以培养或不能培养的微生物，发现一些原来没有被检测到的微生物，且仪器的成本相对较低，具有操作简单、快捷和重复性好等特点，在肉类微生物多样性分析中得到广泛应用[35-36]。然而，由于低分辨率(只能分离<500 bp的小片段)，背景干扰以及基于带强度定量数据[37]，使PCR-DGGE极可能低估微生物的物种组成并高估其丰度。

HTS与PCR-DGGE相比，检测灵敏度高，其应用到微生物生态学研究为认识微生物多样性及其生态功能提供了更加有利的手段。Poka等[38]以萨拉米香肠为研究对象，在提供相同样本16S rRNA可变区的条件下，比较HTS(Illumina MiSeq平台)和PCR-DGGE两种方法分析萨拉米香肠成熟过程中的微生物群落变化，结果表明HTS以更好的分辨率检测到由PCR-DGGE鉴定的物种，也检测到不被PCR-DGGE所识别的物种。尽管HTS能快速高效地对微生物多样性进行分析，但该技术的仪器设备昂贵、测序成本较高，由PCR扩增产生的嵌合序列在数据优化过程中不能得到有效的去除及16S rDNA序列的高保守性，使HTS仍存在着难以区分在物种甚至属水平OTU的问题。RT PCR技术可以测定样品中特定微生物的具体数量，弥补了高通量测序只能获得样品中微生物相对丰度这一缺点，但为确保从样品中分离得到的DNA来自活细胞，基于培养的传统方法是不可缺少的。

4 展望

HTS在微生物多样性研究中的最新进展正在彻底改变人们对肉类微生物群落的评估和理解，特定区域的扩增结合高通量测序生成的数百万条读长，具有覆盖全部微生物的潜力，并且能够更深层次地研究群落中物种之间复杂的相互作用。肉类精深加工和新产品的研发与推广逐渐展开，肉类微生物多样性分析迫在眉睫。因此，每种方法都有其独特的优势和不足之处，只有将多种方法结合起来，才能较为客观全面地反映微生物种类、相对丰度和动态变化的真实信息，这将为肉及肉制品保鲜技术研究、货架期预测鉴定提供理论基础，有利于推动我国肉产业的发展。