体外模拟亚硝化体系中优选阻断NDMA生成的香辛料精油复合抑制剂

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(1.天津农学院食品科学与生物工程学院,天津 300384; 2.天津农学院动物科学与动物医学学院,天津 300384; 3.天津农学院水产学院,天津 300384)

亚硝酸盐通常作为发色剂、抑菌剂和抗氧化剂广泛应用于腌肉制品的加工中[1-2]。亚硝酸盐是N-亚硝胺类化合物的前体物,它极易可能与肉制品加工中所存在的二级胺反应生成N-亚硝胺[3-5]。N-亚硝胺是世界上公认的三大强致癌物质之一,也是四大食品污染物之一[6-7]。随着食品工业的迅速发展,消费者“保健、回归自然”的饮食意识不断加强,对食品的安全性也越来越重视,食品中的N-亚硝胺类化合物的污染问题也备受关注[8-10]。

目前抑制N-亚硝胺形成的研究主要集中于提高亚硝酸盐的清除率和阻断N-亚硝胺形成这两个方面[11-12]。张平等[13]确定了5.03 g的生姜提取物可以清除1 μg的亚硝酸盐。周凤超等[14]在亚硝酸盐的清除试验中研究得出,当加入的花椒、丁香和桂皮提取物分别为10 mL时,亚硝酸盐清除率分别为67.56%、63.22%和65.13%;同时得出,10 mL的丁香提取物对N-亚硝胺的阻断率为78.19%,强于同体积的花椒(30.52%)、桂皮(39.80%)和大蒜(25.41%)。李利华[15]在对亚硝酸盐清除试验中,研究得出四种不同溶剂的胡椒提取物皆具有较好的清除作用。以上研究均是单一香辛料对N-亚硝胺的阻断作用,但是如何从众多的香辛料中筛选出阻断N-亚硝胺效果较好的香辛料,再将它们按一定比例配合形成复合抑制剂,起到提高肉制品风味与阻断肉制品中N-亚硝胺形成的双重作用的研究报道较少。

二次回归正交组合设计,是在因子空间中选择适当的试验点,以较少的试验处理建立一个有效的多项式回归方程,从而解决生产中最优化问题的一种实验设计方法,目的是寻找试验指标和各因子间的定量规律[16]。本研究采用单因素和二次回归正交组合设计相结合的方法,拟构建出胡椒、姜汁、花椒、八角、丁香5种香辛料精油的回归模型及其最优配比,为后期开发安全、美味的肉类产品香辛料组合提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

市售常用的9种香辛料精油(胡椒、姜汁、蒜汁、花椒、桂皮、八角、丁香、小茴香、孜然) 天津顶兴食品有限公司;乳化剂(PEG8000)、柠檬酸钠、盐酸、α-萘胺、无水乙醇、无水对氨基苯磺酸、亚硝酸钠、二甲胺盐酸盐、碳酸钠 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

STARTER3100酸度计 美国OHAUS公司;18Basic匀浆机 德国IKA公司;XMTD-4000电热恒温水浴锅 上海科恒实业发展有限公司;NO.NU-425-400E超净工作台 天美(中国)科学仪器有限公司;T6新世纪型紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 体外模拟亚硝化乳化体系的制备 参照马俪珍等[17]的方法,并稍作修改。分别吸取不同体积的不同香辛料精油至相对应的50 mL的带螺帽的离心管内,各加入0.05 g PEG8000,再加入一定体积的0.5 mol/L pH3.0 的柠檬酸钠-盐酸缓冲液,使其总体积为10 mL。用匀浆机B挡(13000 r/min)乳化处理后,取1 mL配制好的乳液至50 mL的带螺帽的离心管内,加入0.5 mol/L pH3.0 的柠檬酸钠-盐酸缓冲液5.0 mL,加入1 mmol/L的亚硝酸钠0.5 mL,再加1 mmol/L的二甲胺盐酸盐0.5 mL,再加入3 mL的缓冲液,使反应体系的总体积为10 mL,在37 ℃下水浴反应1 h。

1.2.2 NDMA的测定方法 按照1.2.1体外模拟亚硝化反应结束后,参照马俪珍等[17]的方法,取1.0 mL反应的溶液至玻璃试管中,加入0.5 mL 质量分数0.5%的碳酸钠溶液终止反应,将其置于15 W 紫外灯下照射15 min,液面距灯高为15 cm,取出后立即依次加入质量分数1%的对氨基苯磺酸1.5 mL(摇匀)和质量分数0.1%的α-萘胺1.5 mL(摇匀),再加缓冲液至溶液体积精确为5.0 mL,摇匀,静置15 min 显色后在波长525 nm比色测定其吸光度。

1.2.3 单因素实验 研究不同体积浓度的不同香辛料精油乳液对NDMA的抑制率。按1.2.1的方法分别吸取9种香辛料精油0.00、0.05、0.50、1.00、1.50、2.00 mL,使每种香辛料精油在体外模拟亚硝化反应中的终浓度分别为0.0、0.5、5.0、10.0、15.0、20.0 mL/L(表示每L体外模拟亚硝化反应体系中含有各种精油的mL数),反应结束后,按1.2.2进行NDMA的测定,空白对照组为不加香辛料精油的空白乳液,计算每一种香辛料精油在对应体积浓度时的抑制率,并进行分析,试验均重复3次。

表1 5因素二次回归正交组合设计水平取值及编码表Table 1 Combination design level value and coding of 5-factor quadratic regression orthogonal

将x1、x2、x3、x4、x5依次安排在常用正交表L16(215)的第1、2、4、8、15列上,将列中的数字2改成-1;加入10个星点号(轴点)和6个中心点获得五因素二次回归正交组合设计[21]。

1.2.5 验证试验 按照1.2.4将二次回归正交组合设计得出的香辛料精油的最优配比添加到体外模拟NDMA形成的体系中,试验重复6次进行验证。

表2 9种不同浓度香辛料精油添加对NDMA抑制效果(%)Table 2 Inhibition effects of N-dimethylnitrosamines in different volume concentrations of 9 spices(%)

注:结果表示为平均值±标准偏差(n=3);同一行不同大写字母表示有显著性差异(P<0.05)。

1.3 数据处理

运用SigmaPlot 10.0软件作图,采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。选择Duncan’s多重分析法检验组间显著性,显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

9种香辛料精油添加浓度不同对NDMA抑制率变化见表2。由表2可以看出,9种香辛料精油对NDMA的形成均有不同抑制效果。其中,丁香精油对NDMA的抑制率最强,丁香精油的体积浓度在0.5 mL/L时,对NDMA的抑制率为62.05%,体积浓度为5.0 mL/L时,对NDMA抑制率可升高至76.81%,当浓度继续升高至15.0 mL/L时,抑制作用并没有显著增强(P>0.05);其次胡椒、花椒和八角精油对NDMA的抑制性也较强,体积浓度为5.0 mL/L时,对NDMA抑制率均在65.0%以上,当体积浓度再继续增加时,抑制作用保持在70.93%～74.07%范围;而桂皮和孜然精油体积浓度升高至10.0 mL/L时,对NDMA的抑制率才分别达到66.14%和64.79%;小茴香精油浓度为15.0 mL/L时,对NDMA的抑制作用才能达到61.21%;姜汁和蒜汁精油对NDMA的抑制率最弱,随着浓度的增加仅呈现平缓的增加趋势,当浓度升高至最高20 mL/L时,抑制率也仅为37.19%和36.07%。

由表2可知,胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香达到最高抑制率时的体积浓度分别为15.0、15.0、15.0、10.0和5.0 mL/L,但由于香辛料精油风味醇香浓厚,最终确定5种香辛料精油复配时的体积浓度为单因素实验抑制率相对较高的对应体积浓度的1/5,虽然胡椒和八角达到最高抑制率时的体积浓度为15.0和10.0 mL/L,但是胡椒属于辛辣型[22],八角在肉制品的加工中又有一定的应用价值[23],而丁香精油由于其香气浓郁,其体积浓度为胡椒的1/10,所以最终确定在二次回归组合试验设计中胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香零水平的体积浓度为2.0、3.0、3.0、3.0和0.20 mL/L。

由此可知,单一使用某一种香辛料精油要达到较高的浓度(5.0 mL/L以上,丁香精油除外)才能对NDMA的抑制率达到60%以上,然而在实际应用中要考虑到产品的风味,不可能添加如此高的浓度,所以我们选择对NDMA抑制效果较好的丁香、胡椒、花椒和八角精油以较低浓度进行复配,另外考虑到生姜精油在实际应用中所起到的去腥、去异味等特殊作用,尽管它对NDMA的抑制率低,也考虑对其进行进一步优选。

2.2 二次回归正交试验

2.2.1 二次回归正交试验结果的统计 在单因素实验的基础上,运用二次回归正交组合设计(1/2)进行试验,得出的计算结果如表3所示。

2.2.2 回归模型的建立与检验

2.2.2.1 偏回归系数的显著性检验 回归关系方差分析见表4。回归关系达到极显著水平,说明回归方程拟合度良好,R2=0.955,说明本试验设计的因素、水平选择是成功的。

表3 5因素二次回归正交组合设计结构矩阵及计算表Table 3 Structure matrix and calculation of 5-factor quadratic regression orthogonal combination design

2.2.2.2 回归方程的失拟性检验 由表4可得,拟合度F检验为:FLf=4.95,失拟检验不显著,说明该方程拟合度较好,且此回归方程在此试验中有一定意义。

式(1)

y=61.730+0.293x2+2.339x3+0.588x5-0.506x1x4-0.272x3x4-0.540x21-0.681x22-0.963x23-0.681x24-0.916x25

式(2)

式(3)

2.2.3 效应分析

2.2.3.1 主效应分析 由于数据进行了中心化处理,消除了量纲上的差异,可直接根据回归系数绝对值的大小来分析各种精油对NDMA抑制效果的影响[25-26]。由回归方程(1)可知,各回归系数绝对值的大小依次为b3>b5>b2>b1>b4,说明花椒精油和丁香精油对NDMA的抑制效果较好。

图1 单因素与NDMA抑制率的关系Fig.1 Relationship between single factor and NDMA inhibition rate

表4 回归关系方差分析表Table 4 Regression and variance analysis

由图1可知,各编码变量在-1.820～1.820取值范围内,5个编码因素与NDMA抑制率的关系曲线均呈现出先上升后下降的趋势。其中,胡椒精油(Z1)、姜汁精油(Z2)、八角精油(Z4)和丁香精油(Z5)4种香辛料精油在编码变量-1.820≤X≤0的取值范围内时,编码值与NDMA抑制率呈正相关;在编码变量0≤X≤1.820的取值范围内,则反之;且这4种香辛料精油在编码变量为0时,NDMA的抑制率有最大值。而花椒(Z3)则在编码变量为1时,NDMA的抑制率有最大值[28-29]。

2.2.3.3 因素间交互效应分析 由表4可知,对回归方程偏回归系数进行显著性检验,b14在α=0.5水平上有显著性差异,表示x1(胡椒精油)与x4(八角精油)之间存在明显的交互作用;b34虽然在α=0.25水平上没有显著性差异,但x3(花椒精油)与x4(八角精油)之间的交互作用相比于其他因素之间较为显著[30-31]。

2.3 优化试验结果

利用数学求极值的方法,对回归方程(2)求一阶偏导数,寻找所得到的五元二次回归方程的局部最优解。对所建立的编码回归方程,先求其关于5个编码变量的一阶偏导并令其等于零[32]。用Excel解方程组得到x1=0.142、x2=0.215、x3=1.258、x4=-0.303、x5=0.321时,Y有极大值;各因素Z1=2.078、Z2=3.118、Z3=3.692、Z4=2.833、Z5=0.218,即添加胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香的体积浓度分别为2.078、3.118、3.692、2.833、0.218 mL/L时,由回归方程得出抑制率的理论值为63.327%。

2.4 验证实验结果

在体外模拟亚硝化反应体系中添加胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香,添加量分别为2.078、3.118、3.692、2.833、0.218 mL/L,结果表明,香辛料精油的加入对NDMA的抑制率为64.412%±0.25%,与理论值63.327%相当,说明得到的二次回归方程与实际的拟合效果较好。

3 讨论

本试验采用二次回归正交组合设计得到的最优配比,对NDMA的抑制率(验证试验值64.412±0.25%)比单因素试验中最高的NDMA抑制率(花椒的体积浓度为15 mL/L,对NDMA的抑制率为74.07%)低10%,这是因为筛选的最优配比中各浓度要远低于单一香辛料精油。在单因素试验中,丁香精油为0.5 mL/L时,NDMA抑制率为62.05%,胡椒添加5 mL/L,对NDMA的抑制率达65.74%,而5种香辛料精油复配后,丁香精油仅需0.218 mL/L,胡椒精油仅需2.078 mL/L,NDMA抑制率即可达到64.412%±0.25%。所以,在腌肉制品加工中考虑到香辛料精油添加量对风味的影响,本研究的复配香辛料精油在起到抑制肉制品中N-亚硝胺形成的同时,还能赋予肉制品特有的风味,这一研究结果将对安全、味美的肉制品开发具有重要的指导作用。

4 结论

单因素实验结果表明,在体外模拟亚硝化体系中,9种香辛料精油对NDMA的生成皆有抑制作用,但抑制作用的浓度和抑制率各有不同。丁香精油对NDMA 的抑制作用最强,其次是胡椒、花椒和八角精油,小茴香、桂皮和孜然需要较高浓度才表现出一定的抑制率,姜汁和蒜汁精油对NDMA的抑制率最弱。

五元二次回归正交组合设计得到5种香辛料精油的最优体积浓度配比为:当胡椒、姜汁、花椒、八角和丁香的体积浓度分别为2.078、3.118、3.692、2.833、0.218 mL/L时,由回归方程得出对NDMA的抑制率理论值为63.327%,验证试验得到抑制率为64.412%±0.25%,说明得到的模型与实际拟合度较好。