胞外囊泡介导的虫媒病毒传播机制及其应用前景*

王 欣 秦 通 张美娜 孙 毅**

(1. 淮安市清江浦区疾病预防控制中心，江苏淮安 223001；2. 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室，北京市虫媒病与自然疫源性疾病重点实验室, 北京 100071)

虫媒病毒病(arbovirus diseases)，是一类借助蚊、蜱、螨、蛉等媒介节肢动物进行传播、由病毒引起的自然疫源性疾病。这些虫媒病毒病，尽管可防可控，但依旧是导致人类较高病死率的致病元凶(LaBeaud，2008)。更为重要的是，随着当前全球性的气候变暖、城镇化加速和疫源地生境破碎化加剧，虫媒栖息环境和数量的迅速扩张，再加上人群活动频繁造成的暴露机会激增，使虫媒病毒病的健康威胁日益加剧，仅登革热病毒，每年就感染2.5亿人，造成5千万临床病例和2.5万人死亡(Gubler，2002)；而新近发现的发热伴血小板减少综合征及其类似蜱媒病毒造成的人类健康危害、经济困顿和社会动荡也引起了全世界的普遍关注(Silvasetal., 2016)。因此，科学应对虫媒病毒的危害是当前重大传染病防控工作中的重中之重。

研究表明，细胞间信息通讯是虫媒病毒灵活的感染方式和多变的抗免疫策略的生理基础(Sultanaetal., 2020)。虫媒病毒在不同的靶标细胞、组织甚至器官之间的灵活穿梭离不开承担细胞间物质转运和信息通讯的重要工具——胞外囊泡。胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)是直径30～150 nm，由细胞的末期内酶体组件多囊泡体形成的、具有细胞间通讯、转运功能的内吞性纳米级小体。对胞外囊泡功能的认知，最初仅局限于细胞处理代谢废物方面，随着对其内含物的系统分析，胞外囊泡在细胞间转运多肽、蛋白、脂肪、DNA、RNA、microRNA、mitochondrial DNA的作用日渐明晰，胞外囊泡作为细胞间通讯工具的功能也被广泛接受，并作为抗原提呈、药物分子精准递送的新型工具成功应用于临床治疗(Sunetal. 2018; Vanetal., 2018)。然而，相对于哺乳动物胞外囊泡研究与应用的飞速发展，节肢动物细胞可能存在的胞外囊泡及其潜在的科学价值还缺乏系统研究(Meganetal., 2020)。近期，蜱、蚊等节肢动物细胞外泌体等胞外囊泡的相关报道，为明确虫媒病传播的内在机制和分子基础提供了新的思路。为此，本文就虫媒病毒传播相关的胞外囊泡进行系统回顾，从病毒、媒介、宿主相互作用的三方关系总结虫媒病毒传播的共性规律，探讨胞外囊泡介导虫媒病毒传播的内在机制和分子基础。

1 胞外囊泡参与节肢动物吸血和对虫媒病毒传播的介导作用

虫媒病毒对媒介节肢动物的依赖性并不局限于对虫媒病毒的机械承载，媒介节肢动物的涎液、基节腺等分泌物还存在着促感染、抗免疫的生理功能，涎液辅助传播(saliva assistant transmission)已成为虫媒病毒感染恒温脊椎动物(人)的主要方式，媒介节肢动物涎腺及其分泌的涎液也成了关联虫媒病毒、媒介节肢动物和宿主动物三方的关键性介质(Nuttall, 2019; Chowdhuryetal., 2020; Guerreroetal., 2020)。研究表明，蚊、蜱等媒介节肢动物的涎液，除含有水、钠、钾粒子外，还有非肽类分子(腺苷、前列腺素、内源性大麻酚)、肽类(变异素、璃眼蜱素)、蛋白(几丁质酶、脂蛋白、金属蛋白酶、粘蛋白)和宿主源蛋白(免疫球蛋白、珠结合球蛋白)等，最为重要的是还从涎液中鉴定出外泌体等胞外囊泡(Nuttall, 2019; Sunetal., 2020)。这表明包括外泌体在内的胞外囊泡并不单纯是虫媒病毒及其组分的运载工具，还能调控虫媒病毒的扩散(Chvezetal., 2019)。近期研究表明，蜱在吸血过程中，外泌体分子标记-热休克蛋白HSP70的数量增加，提示蜱类涎液中外泌体转运蛋白参与血餐纤维蛋白原的降解过程(Voraetal., 2017)。同时，另一项研究则展示了蜱类涎腺microRNA在宿主—媒介层面上调节宿主基因表达的情况，并锁定这些microRNA(miR-8-3p, miR-425 bantam-3p, miR-317-3p和miR-279a-3p)是来源于涎液中的外泌体(Hackenbergetal., 2017)。因此，有理由推测，蜱类涎腺外泌体可携带热休克蛋白和miRNAs, 进而参与纤维蛋白原的降解和宿主免疫相关基因的调控，进而促进蜱类吸血和虫媒病毒的传播。这些研究表明，媒介节肢动物的涎液、基节液等不仅存在调节宿主免疫的抑制因子、调节因子、抗补体活性成分以及宿主受体识别分子等，还存在着转运这些物质的外泌体或其他胞外囊泡，它们在虫媒病毒传播过程中发挥着不可替代的关键作用(Sultanaetal., 2020)。

多种病毒存在笼络胞外囊泡或外泌体生成途径的传播形式(Laietal., 2015)。登革病毒II和III型病毒感染可导致白纹伊蚊AedesalbopictusC6/36细胞、埃及伊蚊AedesaegyptiAag-2细胞产生含有病毒RNA和病毒蛋白的外泌体，该外泌体还通过含糖蛋白的四跨膜蛋白(tetraspanin)结构域Tsp29Fb感染人上皮成角质细胞(skin keratinocytes, HaCaT)和血管内皮细胞(human vascular endoepithelial, HUVEC)(Voraetal., 2017)。皮质神经元(cortical neurons)外泌体通过对寨卡病毒 (Zika virus, ZIKV) RNA和病毒蛋白的包装和胞外转运，介导着ZIKV在蚊虫细胞间的扩散和传播(Zhouetal., 2019; Kobayashietal., 2020)。此外，新布尼亚病毒SFTSV感染可诱导Hela与Vero细胞早期内酶体特异性标记分子Rab-5及自噬因子标记LC3与布尼亚病毒在囊泡膜上的共定位，并借此将该布尼亚病毒释放至宿主细胞间隙(Silvasetal., 2016)。同时，肩突硬蜱Ixodesscapularis细胞ISE6培养液中发现含有兰加特病毒(LGTV)RNA及其非结构蛋白NS1的外泌体，这些外泌体使LGTV以网格蛋白依赖方式感染上皮成角质细胞HaCaT和鼠神经母细胞N2a (Neuro-2a, N2a) (Zhouetal., 2019)。这些虽是局限于离体细胞的初步研究，但我们有理由相信，外泌体等胞外囊泡介导的虫媒病毒传播模式是极可能存在的。这是因为(1)多种类型的媒介节肢动物和脊椎动物的宿主细胞可以产生外泌体等胞外囊泡，并且胞外囊泡广泛分布在涎液、血淋巴、乳汁、血浆、羊水和尿液等体液或分泌物中。Zhou等(2018)在蜱卵细胞ISE6培养液中发现外泌体等胞外囊泡的存在，并且外泌体中的热休克蛋白HSP70被证实同宿主动物在蜱叮咬部位的纤维化凝集过程相关。(2)外泌体等胞外囊泡所具备的脂质双层膜含有鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、胆固醇、神经酰胺等成分，可保护包括病毒蛋白或病毒颗粒等在内的内含物不受中和降解或侵蚀(Santianaetal., 2018)，使虫媒病毒通过长时间、长距离的胞外运输，仍能保持遗传物质的稳定性和感染力(Févrieretal., 2004)。(3)外泌体等胞外囊泡的膜蛋白除了包含膜转运蛋白flotillin-1、flotillin-2、融合蛋白(GTP激酶、膜联蛋白、Rab蛋白家族等)、跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81、CD82等)、热休克蛋白家族(HSP60、HSP70、HSP90等)等必需的结构蛋白外，还可插组感染病毒的相关蛋白，如糖蛋白glycoproteins(Gn/Gc) 或非结构蛋白(non-structuralproteins，NS)(Silvasetal., 2016)以及受体复合物等，从而帮助病毒将病毒核酸复制体准确定殖在囊泡系统的内膜表面，然后通过囊泡外膜的表面蛋白或多糖等配体识别受体细胞。(4)外泌体等胞外囊泡在运输病毒或病毒元件的同时，还通过转运功能蛋白、核酸(DNA、lncRNA、miRNA、mRNA、cirRNA、miRNA等)或转录因子等活性分子，向受体细胞传送病毒入侵所需的调控信息，进而刺激受体细胞，调控机体免疫或细胞凋亡，实现免疫逃逸和成功入侵。Lenassi等(2010)和Arenaccio等 (2014)发现，外泌体中锚定蛋白Nef可以促进T细胞凋亡，使HIV病人的CD4+T急剧消耗(Lenassietal., 2010; Arenaccioetal., 2014)。Ahsan等(2016)也发现外泌体可通过诱导免疫细胞凋亡的方式促进裂谷热病毒RVFV对机体细胞的感染(Ashanetal., 2016)。而人疱疹病毒6型(human herpesviruse 6, HHV-6)感染细胞后，其外泌体对于MHC-Ⅰ的转运上调，从而下调受体细胞对于病毒的递呈，协助病毒逃避宿主免疫系统(Kotsyfakisetal., 2006; Otaetal., 2014；Masoudetal., 2020)。(5)同时，在形成外泌体等胞外囊泡的过程中，虫媒病毒非结构蛋白泛素化位点激活的囊泡分拣蛋白复合物(如endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)及其介导的分拣包装途径，也为病毒实现其个性化定制包装提供了条件(Fengetal., 2013;Yuetal., 2016)。由此可见，外泌体等胞外囊泡生成途径可能在介导虫媒病毒传播中发挥关键作用(tibrániováetal., 2019)。

黄病毒属的虫媒病毒，包括蚊媒传播的寨卡病毒(ZIKV)、登革病毒(DENV)、西尼罗病毒 (WNV)、黄热病毒(YFV)等以及蜱媒传播的波瓦桑病毒热(POWV)、兰加特病毒(LGTV)、森林脑炎(TBEV)等感染细胞的方式大多是通过网格蛋白clathrin受体介导的内吞方式(endocytosis)。这种内吞式感染方式使虫媒病毒利用胞外囊泡的可能性大大增加(Voraetal., 2018)。兰加特病毒的感染可促进受体细胞的胞外囊泡的分泌，这些囊泡直径大多在30～150 nm之间(Zhouetal., 2019)。此外，兰加特病毒、登革病毒的宿主细胞产生的外泌体包含着病毒的RNA、包膜蛋白E以及非结构蛋白NS1，这表明，虫媒病毒利用宿主细胞外泌体进行细胞间的信息和物质传递。更有趣的是，DENV2的全长RNA和发热伴血小板减少综合征病毒SFTSV的全长RNA分别在其宿主细胞的胞外囊泡中检出(Voraetal., 2018; Silvasetal., 2016；Goldetal., 2020)。因此，胞外囊泡也可能转运完整病毒粒子，有人推测胞外囊泡介导的虫媒病毒传播可能以随时出发的快餐车方式，加速病毒基因组的复制、翻译和糖蛋白的合成。鉴于黄病毒颗粒一般在40～60 nm之间，外泌体可包含2～3个黄病毒颗粒，大的胞外囊泡甚至可携带6～8个病毒粒子。从兰加特病毒感染的蜱细胞和登革病毒感染的蚊细胞来看，利用携带病毒遗传信息及蛋白信息的外泌体或胞外囊泡比病毒直接感染更加有效(Taanketal., 2017; 2018; Zhouetal., 2019)。此外，携带病毒组分的感染性外泌体可有效感染人上皮成角质细胞和内皮细胞，表明蜱和蚊类的外泌体可以同宿主的靶标细胞以融合内吞的方式，促进虫媒病毒的传播。同时，寨卡病毒(ZIKV)和西尼罗病毒(WNV)病毒RNA在神经元外泌体的存在，也为虫媒病毒的嗜神经扩散提供了依据(Kobayashietal.，2020)。

与此同时，媒介节肢动物体内的胞外囊泡也在虫媒病毒的扩散和应对节肢动物的天生免疫中发挥重要作用。通过网格蛋白受体介导的内吞方式，虫媒病毒E蛋白与膜表面的受体融合进而感染媒介节肢动物。正如前述，节肢动物的围食膜、中肠上皮、涎腺以及卵泡细胞的外泌体都可能介导虫媒病毒在媒介节肢动物体内的扩散和传播。这些靶标细胞都可分泌产生胞外囊泡(Laietal., 2015)，胞外囊泡表面的四聚穿膜蛋白Tsp29Fb编码基因的沉默或抗体封闭可显著降低蚊类细胞的登革病毒载量和外泌体数量(Voraetal., 2017)，同时，感染细胞分泌的外泌体显著大于未感染细胞分泌的外泌体(Reyes-Ruizetal., 2019)，这表明Tsp29Fb介导的登革病毒在节肢动物体内复制和扩散作用不容忽视。因此，胞外囊泡介导的虫媒病毒在节肢动物和脊椎动物细胞间的传播和扩散是普遍存在的。

2 胞外囊泡对虫媒病毒传播介导的主要途径

2.1 虫媒病毒的水平传播

蚊、蜱等媒介节肢动物对虫媒病毒的水平传播，通常以经期传播和和共同吸血传播的(cofeeding transmission, CFT)方式进行，以中肠、涎腺、血淋巴等为靶标的经期传播，可促使虫媒病媒逃避媒介节肢动物变态发育过程中的组织溶解和再生过程的胁迫，从而使虫媒病毒在媒介节肢动物体内得以长期保存。蚊类的水、陆阶段性生活习性以及蜱类的耐饥、寿命长等特点赋予了虫媒病毒在自然界长期保存的基础条件(Boothetal., 1991)。媒介体内多样化的受体细胞及其胞外囊泡可为虫媒病毒提供多样化的存贮方式，并通过不同的外泌体等胞外囊泡在靶标细胞、组织或器官之间进行信息通讯。同时，在涎液协助下，通过叮咬同一寄主，虫媒病毒可从感染的媒介节肢动物个体传播到未感染个体，而不引起宿主动物的感染(Gordonetal., 1993; Labudaetal., 1997)。这种共同吸血传播模式可能与外泌体随时可用快餐车式的传播方式及宿主初级免疫细胞的快速扩散密切相关，可有效避免脊椎动物宿主的次级免疫胁迫，无疑是虫媒病毒自然适应积极策略之一。尽管对于媒介节肢动物靶标细胞的胞外囊泡的研究才刚刚起步，但已有的研究表明，和其他病毒类似，大多虫媒病毒(黄病毒属等)非结构蛋白域存在E3-ubiquitin-ligase泛素化功能位点(Bharajetal., 2016; Preetietal., 2017)，该位点可与细胞及其胞外囊泡的囊膜表面特异性结合，并通过泛素化修饰、启动由ESCRT(转运必需内体分选复合物)执行的病毒及其传播相关组分的分选、外泌体生成和转运过程(Jeremyetal., 2010；Jörgetal., 2013)。通过类似的机制，虫媒病毒及其传播相关组分可识别宿主细胞，并通过宿主细胞CC亚族趋化因子受体(cysteine-cysteine chemokine receptor 5, CCR5)通路或RANTES(激活T淋巴细胞表达与分泌调控因子)诱导单核细胞、T淋巴细胞及嗜酸性细胞的分化，进而实现免疫抑制或逃逸目的(Arenaccioetal., 2014)。

2.2 虫媒病毒的垂直传播

除水平传播外，虫媒病毒还具有通过卵巢感染传播至子代的经卵传播，亦称垂直传播。在媒介节肢动物体内，卵巢发育与卵子成熟都离不开血淋巴中的营养与氧气供应，在此过程中，虫媒病毒随血淋巴的流动进入卵巢(Vlastaetal., 2019)。目前，虫媒病毒进入卵巢的分子机制尚不清楚，推测其可能的途径主要包括基于肌动蛋白的微管活动机制(actin based tubule motility)、卵黄蛋白原(vitellogenin，Vg)介导的病毒入侵机制和卵黄蛋白吸收入侵机制(endocytic yolk uptake mechanism)等。研究发现，虫媒病毒的非结构蛋白(non-structural proteins, NSs)可与肌动蛋白、肌球蛋白(myosin)、卵黄蛋白原、水孔蛋白(tropomoduli)以及携脂蛋白前体(lipophorin precursor)等特异性互作(Chotiwanetal., 2018; Santianaetal., 2018)，进而诱导卵巢微纤管(microvilli)的生成和卵黄蛋白的吸收，这一过程促使虫媒病毒进入卵泡细胞继而感染卵子(Bronsomsetal., 2011; Brackneyetal., 2016; Cabezasetal., 2017; Chávezetal., 2019)。其中，虫媒病毒的非结构蛋白可能发挥着关键作用，其分子转运是否同卵巢细胞的外泌体或胞外囊泡有关，尚不得而知，至于能否归因于虫媒病毒非结构蛋白的泛素化受体结合机制(Bharajetal., 2016; Preetietal., 2017)，还需进一步研究。

3 胞外囊泡在未来虫媒病毒病防控中的应用前景

由于蚊、蜱等媒介节肢动物可以向其涎液中释放具有转运和信息通讯功能的外泌体等胞外囊泡，因而，涎液中胞外囊泡的深入研究将为揭示虫媒病毒传播的内在机制和分子基础提供全新的研究思路(Manningetal., 2018)。然而，由于媒介节肢动物涎腺、血淋巴等体液的体量限制，从这些体液或分泌物中分离胞外囊泡或外泌体的工作具有很大的挑战性。随着转录组和蛋白质组高通量测序技术的广泛应用，这些限制条件势必得以显著改善。通过高通量技术对媒介节肢动物外泌体等胞外囊泡的系统分析，将可以明确这些囊泡体或外泌体所携带的活性成分的组成全貌，明确参与虫媒病毒的扩散与传播的活性组分，以及参与媒介节肢动物天生免疫调节和宿主动物被动免疫逃逸机制的具体组分，进而揭示这些囊泡或外泌体参与虫媒病毒传播的具体机制。在未来一段时间内，集中解析媒介节肢动物的胞外囊泡或特定外泌体与靶标细胞的结合机制及其对虫媒病毒传播的调控作用，将是该领域研究的关键科学问题。鉴于针对蚊、蜱等媒介节肢动物的传播阻断疫苗的空白，利用外泌体等胞外囊泡抗原研发新型传播阻断疫苗也将是未来虫媒传染病防控的有效手段(Jungbauer, 2018)。这些工作也将为未来发展基于胞外囊泡或外泌体的虫媒病治疗对策提供理论基础和技术支撑。