外泌体微RNA在三阴性乳腺癌中的研究进展

周聪，柴效科，肖惠，宋爱琳

(兰州大学第二医院普外科，兰州 730030)

乳腺癌是女性最常见的癌症，占女性患者新发癌症的30%，2018 年国际癌症研究机构发布的数据显示，女性乳腺癌的发病率为46.3/10 万，同时也是女性患者癌症死亡的最主要因素，病死率为13.0/10 万[1]。乳腺癌是一种由不同分子亚型组成的异质性疾病，其发生与多个基因突变有关，因此对于不同亚型的乳腺癌，应当采取不同的治疗策略[2]。圣加仑会议共识将乳腺癌细分为Luminal A型、Luminal B型、人类表皮生长因子受体2阳性型和三阴性4种临床亚型[3]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)占乳腺癌的15%～20%，具有恶性程度高、侵袭转移率大、化疗药耐药性和预后差等特点[4]。目前，乳腺癌的诊断主要依靠患者自检、影像学检查和组织穿刺活检，治疗方式主要包括手术治疗、化疗、放疗、新辅助治疗及针对信号通路的靶向治疗[5]。但传统检测手段不能及时发现早期病灶，导致患者在确诊时可能已经发生了远处转移，且TNBC没有明确的有效靶点，总体治疗效果不佳，远处转移和不良预后是导致患者死亡的主要因素。因此，亟待寻找针对诊断早期病变的肿瘤标志物。越来越多的证据显示，各种生物活性分子参与了乳腺癌的发展过程，如蛋白、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微RNA(microRNA，miRNA)等[6-8]。现就近年来TNBC中外泌体miRNA的研究予以综述，以期为临床诊断和治疗的潜在价值提供新发现。

1 外泌体miRNA

外泌体作为一种胞外运载工具，是一种直径为40～100 nm的膜性囊泡，它可以由多种细胞产生。外泌体的产生源于细胞膜内吞形成早期的胞内小体，装载多种胞内物质形成胞内多泡体，最后通过胞吐作用释放到细胞外形成外泌体，存在于尿液、羊水、唾液、腹水、脑脊液、外周血等其他体液中[9-12]。外泌体于1985 年首次发现，被认为是一种无生物活性的运输载体[13]。从1996年发现B细胞分泌外泌体可以促进T细胞的增殖开始，有学者猜测外泌体可以作为一种新的细胞间交流途径，供细胞之间传递多种生物活性分子，如脂质、蛋白质、信使RNA(messenger RNA，mRNA)、lncRNA及miRNA[14-19]。miRNA首次发现于线虫中，是一种高度保守的单链非编码RNA，包括17～25个核苷酸，在转录后阶段与mRNA的3′非翻译区结合，负性调节人类基因组中30%的基因表达，调节过程涉及3种可能的机制：抑制翻译启动、启动后抑制翻译和使目标mRNA不稳定，导致mRNA的降解或翻译抑制[20-21]。一个miRNA可以匹配多个mRNA，执行多种生物活性。miRNA可存在于多种生物体液中，与癌细胞的增殖、凋亡、免疫逃逸、侵袭转移和化疗药耐药性有密切联系[22-26]。近年来，研究发现外泌体可装载传递miRNA至邻近细胞执行功能、调节肿瘤的发生发展[27]。在癌细胞中产生的外泌体数量多于正常细胞，并且外泌体携带生物活性分子存在于多种体液中，因此将外泌体作为肿瘤检测的非侵入性生物标志物具有较大的潜在价值[28]。

2 外泌体miRNA在TNBC细胞增殖中的研究

癌细胞增殖增加和凋亡减少有助于肿瘤的发生和进展，外泌体可以被传递至正常的细胞，促使正常细胞转变为癌细胞，改变其增殖和凋亡状态。Melo等[29]发现，将正常乳腺上皮细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞分泌的外泌体共同培养后可表现出更强的细胞活力，而这种细胞活力可以被Dicer酶破坏，该酶是一种核糖核酸内切酶，能降解癌细胞传递的miRNA前体，说明癌细胞分泌的外泌体中有能改变细胞活力的miRNA存在。研究证明，在MDA-MB-231乳腺癌细胞中外泌体miR-1246多于其他乳腺细胞[30]。同样在16例乳腺癌患者中学者也发现，miR-1246以相对高的浓度富集于患者的血浆中，miR-1246通过外泌体的运输进入正常细胞，抑制细胞周期蛋白G2的表达，细胞周期蛋白G2是一种抑癌基因，其表达水平和患者预后呈负相关，虽然这16例病例并不完全是TNBC患者，但也说明了在外周血中能够利用外泌体miRNA判断患病风险和疾病预后的可能性，而在TNBC中miR-1246是否丰富仍需要进一步研究证明[31]。另外，在癌细胞中高水平表达的外泌体miR-21和miR-10b也能通过抑制抑癌基因(人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因和同源异形盒D10)增强受体细胞的增殖能力[32-33]。癌细胞可以分泌促肿瘤miRNA，正常细胞也能分泌抑制肿瘤的miRNA来改变肿瘤细胞的生存状态。外泌体miR-503在正常乳腺细胞中分泌较多，而在TNBC细胞中分泌较少，它和肿瘤进展相互克制，高表达的miR-503可以抑制TNBC细胞的细胞周期素D2和D3表达，细胞周期素D2和D3是细胞周期蛋白的正向调节蛋白，其扩增可能导致细胞周期蛋白异常活化、细胞周期紊乱，加速肿瘤的发生发展[34]。且在经过新辅助化疗的乳腺癌患者的血浆中，能检测到更多的miR-503，故其或许能成为一种提示乳腺癌患者预后的标志物。

3 外泌体miRNA在TNBC血管生成中的研究

血管生成是肿瘤发生、发展以及转移的重要条件。肿瘤血管生成需要肿瘤微环境中多种成分，包括促血管生成因子和抗血管生成因子，前者包括血管内皮生长因子、胎盘生长因子、血小板源性生长因子、表皮生长因子，后者包括血管抑素、内皮抑素、金属蛋白酶组织抑制物以及α干扰素等。因此，针对血管生成的靶点开发新药是抗肿瘤药研究的热门方向。二十二碳六烯酸是一种具有抗血管生成特性的天然化合物，可作为乳腺癌防治的膳食补充剂。Hannafon等[35]分离收集了经过二十二碳六烯酸处理的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的外泌体，在这类外泌体中let-7a、let-7、miR-21、miR-23b、miR-27a/b和miR-320b等表达较多，而这些miRNA具有抗血管生成、抗肿瘤的作用。用肿瘤细胞外泌体共培养内皮细胞后，miR-23b和miR-320b的表达减少，抗血管生成相关的基因表达减少，且能观察到管腔的形成，敲除外泌体释放相关的蛋白(如Rab GTP酶和Rab27A)可阻断这种促血管生成效应。另外，正常细胞来源的外泌体中包含多种作用于血管生成靶点的miRNA(如间充质干细胞来源的外泌体miR-100)可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/缺氧诱导因子-1α信号轴减少TNBC细胞血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体1蛋白的表达，抑制肿瘤血管生成，对抗癌细胞的侵袭能力[36]。此外，间充质干细胞中的外泌体miR-16也能抑制4T1乳腺癌细胞的血管内皮生长因子表达，抑制肿瘤血管形成[37]。外泌体miRNA不仅能抑制肿瘤血管形成，肿瘤细胞来源的外泌体miRNA还能促进肿瘤的发展。低氧状态下，TNBC细胞能分泌更多的外泌体、表达更高水平的miR-210[38-39]。有研究表明，miR-210与肿瘤转移有密切联系，癌细胞通过外泌体将miR-210传递给内皮细胞，促进肿瘤新生血管形成和癌症发展[40]。

4 外泌体miRNA在TNBC免疫过程中的研究

近年来，乳腺癌免疫疗法成为肿瘤治疗的新方向，一项Ⅲ期临床试验结果表明，程序性细胞死亡配体1抑制剂联合白蛋白紫杉醇可明显延长程序性细胞死亡配体1阳性TNBC患者的生存时间，另外程序性细胞死亡受体1抑制剂联合细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、雄激素受体调节剂在Ⅰ期或Ⅱ期临床试验中也表现出良好的效果，证明乳腺癌免疫疗法具有良好的前景[41]。因此，研究外泌体miRNA在肿瘤免疫中的作用，对理解其在TNBC中的诊治价值具有重要意义。外泌体miRNA在肿瘤细胞和免疫细胞两种完全不同的细胞之间互相传递，一方面可以促进肿瘤的发生发展，另一方面又可以抑制肿瘤的进展，其功能主要取决于传递miRNA的种类。在TNBC中，肿瘤相关巨噬细胞分泌的miRNA不仅与癌细胞的侵袭转移能力相关，而且与患者的预后关系密切[42]。通过微阵列分析发现，miR-223在巨噬细胞中高表达，而在TNBC中低表达，当癌细胞与巨噬细胞来源的外泌体共培养后，miR-223可运输至肿瘤细胞增强乳腺癌细胞的侵袭能力[43]。同时，乳腺癌细胞来源的外泌体也能通过核因子κB途径诱导炎症反应，促进肿瘤的发展[44]。另外，miR-16不仅能抑制肿瘤血管的形成，还参与了肿瘤免疫过程。Jang等[45]研究表明，绿茶提取物表没食子儿茶素没食子酸酯可促使4T1乳腺癌细胞中miR-16高表达，外泌体将miR-16运输至巨噬细胞，抑制肿瘤相关巨噬细胞的渗透，诱导巨噬细胞向具有肿瘤抑制功能的M1型分化。

5 外泌体miRNA在TNBC细胞侵袭转移中的研究

肿瘤转移是乳腺癌患者死亡的主要原因，乳腺癌最常见转移的部位包括肺、肝、骨和皮肤，探究乳腺癌如何增强癌细胞的侵袭性对于改善患者预后和生活质量具有重要意义[46]。尤其对于TNBC，其恶性程度更高、转移概率更大、患者预后更差，研究TNBC转移机制在临床上有切实意义。在63例TNBC患者中，外泌体miR-939呈高表达状态，其作用于钙黏蛋白，增加内皮细胞的渗透性[27]。在细胞实验中，MDA-MB-231 TNBC细胞表达的外泌体miR-939能下调钙黏蛋白，导致内皮细胞屏障的破坏和肿瘤转移，而miR-10b的表达与转移的发生率相关[47]。癌细胞来源的外泌体miR-10b能作用于正常乳腺上皮细胞的同源异型盒基因D10和krupple样因子4基因，增强其侵袭能力[48]。外泌体miR-105能下调内皮细胞的闭锁小带蛋白1基因表达，破坏内皮细胞之间的连接和屏障功能，增加血管通透性，以致乳腺癌细胞更易外渗至远处器官[49]。外泌体miR-181c能靶向作用于内皮细胞中的3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1，导致肌动蛋白动力学和纤维排列异常，减弱细胞间紧密连接，促使乳腺癌脑转移[50]。除了促肿瘤效应的miRNA外，也有其他miRNA能够发挥抑制肿瘤进展的作用。外泌体miR-770能抑制MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞的上皮-间充质转化途径，从而降低癌细胞的侵袭能力[51]。另外，外泌体miR-134、miR-205、miR-31也可下调TNBC细胞的转移侵袭能力[52-53]。

6 外泌体miRNA在TNBC细胞耐药中的研究

蒽环类、环磷酰胺、紫杉烷类是大多数乳腺癌治疗化疗方案的基础药物，而肿瘤化疗耐药是导致乳腺癌患者治疗失败的普遍原因，其机制可能涉及药物靶点的突变、药物快速清除和药物转运改变等。一些外泌体miRNA已被证实可调节乳腺癌细胞对化疗药物的化疗耐药性[54-55]。在多西他赛、表柔比星、长春新碱耐药的MDA-MB-231细胞的外泌体表达谱中，可检测到miR-4443、miR-574-3p、miR-7847-3p、miR-423-5p、miR-4298、miR-3178、miR-6780b-3p、miR-7107-5p、miR-744-5p、miR-4258、miR-138-5p和miR-210-3p的表达水平明显上调[56]。另外也有研究表明，外泌体miR-1246可以抑制细胞周期蛋白G2，增强TNBC细胞对多西他赛、表柔比星、吉西他滨的耐药性[30]；外泌体miR-134可以增强癌细胞对铂类药物和抗热激蛋白药的敏感性[52]；外泌体miR-770能抑制癌细胞对多柔比星的耐药性[51]。基质细胞来源的外泌体也能影响肿瘤细胞对化疗药的耐药性，如基质细胞分泌的外泌体miR-127、miR-197、miR-222和miR-223能抑制TNBC基质细胞衍生因子1的表达，并将癌细胞阻滞在G0期[57]。基质细胞衍生因子1是一种趋化因子，与其受体CXC趋化因子受体4结合能促进肿瘤的生长、转移，但是进入静止期的癌细胞在基质细胞衍生因子1表达受抑制时，却能增强对化疗药的耐药性。

7 靶向外泌体miRNA的治疗方法

外泌体miRNA在癌症进展中的重要作用不容忽视，因此研发关键miRNA的新药意义重大。据报道，一些临床抗癌药物的机制也部分依赖于外泌体miRNA，D-鼠李糖β常春藤是一种三萜系化合物，能减少外泌体的释放，进而降低miR-130a和miR-425水平，抑制癌细胞的生长[58]。同样紫草素也能抑制外泌体释放，减少miR-128表达，抑制癌症发展[59]。另外，二十二碳六烯酸可以作为乳腺癌防治的一种膳食补充剂，能增强let-7a、let-7、miR-21、miR-23b、miR-27a/b和miR-320b等miRNA表达，减少促血管生成相关蛋白表达[35]。

8 小 结

肿瘤无创诊断技术在未来很可能蓬勃发展，外泌体miRNA的实验研究对其临床无创诊断价值提供了很好的评估，同时也给肿瘤治疗带来新的方向，或阻断外泌体中促肿瘤型miRNA的包装、释放，或降低其生物活性、耗竭外周循环中的miRNA。但现阶段释放和靶向运输机制尚未得到明确的阐释，且外泌体囊泡如何选择特定的miRNA包装仍不清楚，应用到临床也有一些问题需要解决(如快速分离和纯化)。目前分离外泌体最普遍的方法为超速离心法，然后检测其直径大小，蛋白免疫印迹法虽可测定表面生物标志物(如膜蛋白CD63、CD81、CD9)，但因其分离成本高、耗费时间长、纯度不高，故临床未能普及[60]。检测miRNA时，可采用RNA测序或实时定量聚合酶链反应等实验方法，但在操作过程中，随着时间的推移miRNA很容易被降解，对结果的准确性产生极大影响。目前，越来越多的文献报道了外泌体分离和检测的新技术。Lewis等[61]报道了利用交流电保留外泌体、剔除其他颗粒杂质的技术，并利用外周血的外泌体进行了胰腺癌的筛查，整个筛查过程不超过1 h，大大缩减了外泌体实验技术的时间。另外，Ko等[62]利用轨道蚀刻磁性纳米孔技术分离外泌体，进行胰腺癌的诊断；Lamichhane等[63]利用声波将干扰小RNA装载进胞外囊泡颗粒中。总之，外泌体在肿瘤领域的发现不断被丰富，且其在体内运输的精准性也不断提高，故外泌体miRNA很可能成为一种新的肿瘤检测和靶向治疗方案。