乳腺导管原位癌浸润机制的研究进展

张雪，薛美玲，段秀庆

(哈尔滨医科大学附属第一医院乳腺外科，哈尔滨 150001)

导管原位癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)又称为导管内癌，病变从末梢导管小叶开始，经过细胞异常生长的不同阶段，最终发展为DCIS。构成DCIS的细胞具有恶性细胞的特征，但被局限在正常的导管结构内，并未侵袭肌上皮细胞层和基膜。随着浸润性成分的出现，DCIS演变为浸润性导管癌(invasive ductal carcinoma,IDC)，因此DCIS被认为是IDC的癌前病变[1]。近年的研究也检测到同一患者的DCIS成分与浸润性成分的分子相似性[2]。其中，最能证明DCIS 到 IDC是一个连续发展过程的证据是其影响着同一解剖部位。在对 DCIS 的纵向研究中，活组织检查发现，20%～25%的DCIS在同一乳房的同一象限内演变成了IDC[3]。虽然DCIS可治愈，但因其是潜在致命的侵袭性乳腺癌的非专一性前体[4]，故其危害性不可忽视。自20世纪80年代乳房X线照射技术问世以来，DCIS的诊断率逐步提高。在美国新诊断的乳腺癌中，DCIS约占20%[5]。DCIS向IDC发展的机制尚待阐明。到目前为止，仍不能准确区分哪些乳腺癌会保持持续惰性而进展为IDC。因此，不管是否需要进行辅助放化疗或内分泌治疗，所有被诊断为DCIS的患者均被不加选择地进行手术切除治疗[5]。这对于找出高侵袭性进展DCIS的发生机制，并行针对性治疗提出了挑战。现就肿瘤微环境中细胞及细胞外基质、表观遗传学及基因变异在DCIS浸润过程中发挥的作用予以综述。

1 肿瘤微环境中细胞和细胞外基质的作用

肿瘤微环境是指肿瘤发生、生长、转移以及肿瘤细胞所处的内外环境，包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，并与肿瘤细胞自身(核和胞质)的内在环境有关。研究表明，构成微环境的细胞(肌上皮细胞、成纤维细胞、白细胞)、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)以及分子可以调节乳腺癌的组织特异性以及乳腺癌细胞的生长、存活、极性以及侵袭行为[6]。因此，肿瘤微环境对于正常乳腺的发育和乳腺肿瘤的发生非常重要[7]。

1.1肌上皮细胞 在正常乳腺中，肌上皮细胞与基膜接触，包围腔上皮细胞，后者依次排列在导管和腺泡中。肌上皮细胞被认为是正常乳腺发育和功能作用的调节剂，在泌乳过程中通过其收缩功能使乳汁从导管内排出，且对腔上皮细胞的极性、增殖和分化也有重要作用。肌上皮细胞通过分泌蛋白酶抑制剂以及下调基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的水平影响肿瘤细胞的生长、侵袭和血管生成。组织学上，肌上皮细胞的丢失是区分DCIS和IDC的一个关键因素，人们对肌上皮细胞丢失的机制以及是否调节肿瘤细胞的侵袭进行了广泛研究。抗平滑肌抗体、肌球蛋白重链、s100、p63、CD10以细胞角蛋白14/17等标志物可识别肌上皮细胞。DCIS异种移植模型的发展为研究DCIS的进展机制奠定了基础[8]。理想的模型是将人乳腺癌细胞注入乳腺导管系统后引发导管内病变形成，并侵入周围组织[8]。Russell等[9]发现，肌上皮细胞在入侵前会丢失其自身的某些标志物，如p63、钙结合蛋白和平滑肌肌动蛋白，而这些标志物的丢失在人类DCIS样本中也得到证实，表明肌上皮细胞的分化在侵袭之前已被破坏，这些标志物的丢失可能是DCIS进展的一个标志。对人类活检样本的进一步研究发现，在DCIS的肌上皮细胞中，肌球蛋白重链和CD10的低表达与并发间质侵犯的风险有关[10]。因此，将人乳腺癌细胞-10与DCIS异种移植模型中具有低侵袭性表型的衍生物或其他细胞系进行比较，可能有助于识别肿瘤细胞释放的旁分泌因子，旁分泌因子减少了肌上皮细胞分化标志物的表达，识别这些因子将帮助研究者发现DCIS入侵的其他潜在标志物。

1.2癌症相关的成纤维细胞 正常成纤维细胞通过产生和重构ECM维持细胞外环境。癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)在促进肿瘤进展的过程中发挥了重要作用。CAFs具有异质性，其中一部分被鉴定为表达α平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞，其他被鉴定为表达成纤维细胞的激活蛋白、肌间线蛋白、S100A4蛋白等[11]。Orimo等[12]研究表明，CAFs可通过分泌基质细胞衍生因子-1/CXC趋化因子配体12促进肿瘤生长和肿瘤血管生成，CXC趋化因子配体12通过CXC趋化因子受体4以旁分泌的方式增加肿瘤细胞的增殖。肝细胞生长因子是另一种CAFs衍生因子，可通过c-Met受体酪氨酸激酶发挥作用，被认为是促进肿瘤进展和转移的重要因子[13]。正常乳腺成纤维细胞与乳腺癌细胞共培养可促进成纤维细胞分泌肝细胞生长因子，并提高肝细胞生长因子的促肿瘤活性[14]。CAFs的起源已被广泛研究，并提出了多种假设。一种是来源于天然间质成纤维细胞，其表型已被邻近肿瘤上皮细胞持续异常的信号所改变；也可由骨髓来源的间充质干细胞分化，这些间充质干细胞在肿瘤衍生因子的刺激下被募集到肿瘤部位。从先前接受过同种异体骨髓移植的患者的肿瘤中鉴定出骨髓来源的细胞支持了这一假设[15]。但另一项研究表明，某些异种移植物通过激活和募集骨髓来源的细胞诱导弱致瘤细胞系的生长和转移[16]，特别是表达颗粒蛋白的骨髓源性细胞，其既能促进肿瘤进展，也能促进成纤维细胞生长。这些数据以及来自其他实验室的数据[17]支持了肿瘤源性信号刺激骨髓产生和释放骨髓源性细胞，并促进肿瘤进展的这一假设。因此，靶向骨髓来源的细胞可能会影响局部和转移性疾病的治疗。

1.3白细胞 浸润性白细胞在肿瘤的发展中发挥重要作用，但其介导免疫和肿瘤细胞串扰的机制却鲜为人知。DCIS中存在大量浸润性白细胞，伴有局灶性肌上皮细胞层破坏[18]，表明白细胞可能在侵袭性进展中发挥作用。研究发现，肿瘤相关巨噬细胞通过激活表皮生长因子受体，分泌蛋白酶以及激活肿瘤细胞间的旁分泌信号，促进血管生成、ECM降解以及肿瘤侵袭[19]。集落刺激因子-1缺陷小鼠丢失巨噬细胞对肿瘤的发生无影响，但大大减缓了恶性进程[20]。用小鼠集落刺激因子-1反义寡核苷酸或集落刺激因子-1小干扰RNA处理免疫缺陷小鼠中源自人乳腺癌细胞-7的异种移植物发现，其通过减少巨噬细胞浸润、MMP和血管内皮生长因子-A的产生以及内皮细胞增殖，抑制乳腺肿瘤的生长[21]。可见，巨噬细胞在乳腺癌的进展过程中有重要作用，并为肿瘤相关巨噬细胞与不良临床预后的关联提供了合理解释。除巨噬细胞外，其他免疫细胞也参与了乳腺癌的发展。在乳腺癌的小鼠模型中，使用白细胞介素-2免疫毒素融合蛋白后，CD4+T淋巴细胞的数量增加，且T细胞的系统性耗竭抑制了肿瘤生长，并维持强而持久的抗肿瘤免疫反应[22]。由于这些细胞是细胞介导免疫所必需，表明可能存在针对乳腺肿瘤的主动免疫反应，其强度可能会影响远处转移的风险。

1.4肿瘤进展中的基质重构 乳腺癌的ECM存在明显异常，其可能促进了肿瘤进展。MMP主要由成纤维细胞合成，通常参与组织重构和切口愈合。除降解ECM外，MMP还可激活趋化因子、细胞因子、黏附分子以及生长因子，这些因子通过增加肿瘤细胞增殖或促进血管生成促进肿瘤进展[23]。乳腺肿瘤的异常生理特征(如异常胶原交联导致ECM变硬)也会导致肿瘤进展。这种硬化产生的力量导致整合素和生长因子信号转导增强，从而促进入侵。赖氨酰氧化酶是一种常见于乳腺肿瘤的胺氧化酶，在乳腺癌的MMTV-Neu模型中，其促进胶原蛋白交联，增强ECM硬化，其抑制作用延缓了肿瘤进展，减轻了肿瘤负担[24]。多项研究检测了ECM对DCIS侵袭性的影响。Wallace等[25]认为，产后复旧是肿瘤进展的驱动力。产后复旧是断奶后哺乳期乳腺恢复到怀孕前状态的过程。复旧的乳腺和乳腺肿瘤微环境具有共同的特征，即促进肿瘤胶原蛋白表达、MMP上调、巨噬细胞浸润以及血液和淋巴管重构。与未产患者和产后窗外诊断的患者相比，产后复旧患者更易患侵袭性疾病，并具有更高的转移风险。信号蛋白-7a、环加氧酶-2和胶原蛋白均在复旧的乳腺中表达[25]，其共同作用使乳腺癌的无转移生存率降低。另有研究表明，基质细胞中溶血磷脂氧化酶的高表达与ECM修饰酶家族的侵袭和转移有关[26]。

2 表观遗传学

表观遗传学改变，即肿瘤细胞内基因表达的可遗传改变，不涉及DNA序列的改变，也可以解释目前在DNA序列水平上DCIS与IDC的差异。从正常乳腺上皮到DCIS，DNA甲基化通常会增加，但大部分研究发现，DCIS与IDC中启动子的超甲基化水平相似[27-29]。这表明，DNA甲基化的改变是乳腺癌发生的早期事件。组蛋白修饰与DNA甲基化共同作用是基因调控的关键，赖氨酸特异性去甲基化酶(lysine specific demethylase，LSD)1是一种组蛋白甲基化擦除剂，作用于组蛋白H3K4和H3K9[30]。LSD1在乳腺肿瘤中高表达，在低、中、高级别DCIS与浸润性乳腺癌中，LSD1的表达水平随级别的增高而升高，再次表明乳腺癌进展中存在早期表观遗传事件[31]。DCIS和IDC均有其特异的基因甲基化。Melnikov等[32]采用微阵列甲基化分析方法发现，突变型p73、蛋白激酶C delta结合蛋白和mut S同种组织蛋白2基因的甲基化只与DCIS有关，与IDC无关；血小板反应蛋白l和脂肪酸结合蛋白3等基因的甲基化只与IDC有关,而与DCIS无关。近年来研究发现，MIMAS也在乳腺癌的进展中发挥关键作用，可以调控包括组蛋白去乙酰化酶、DNA甲基转移酶和多梳蛋白在内的表观遗传修饰物[33]。

3 基因变异

IDC是最常见的乳腺癌类型，占乳腺癌病例的80%，而45%～78%的IDC与DCIS有关[34]。已有证据表明，DCIS是IDC的非专一性前体[1]，但用于区分DCIS和IDC的强大转录组或基因组特征仍在研究中。在研究过程中出现了两种理论，在DCIS向侵袭性疾病转变过程中选择了具有特定遗传变化的亚克隆，这导致DCIS与侵袭性样本之间特异性扩增和突变患病率的差异[35]。与此同时，有学者提出了一种多克隆进化理论，该理论假设DCIS中的多个克隆在DCIS向IDC的过渡过程中共同迁移[36]。对癌前、浸润前和IDC的基因表达谱进行分析表明，在转录组水平上，具有相同组织学分级的浸润性病变和浸润性乳腺癌的基因表达模式极为相似[37]。此外，增殖和凋亡相关蛋白雌激素受体和孕激素受体在DCIS和IDC的原位和侵袭性成分中有相似的表达模式，提示可能在转化过程中发挥作用[38]。虽然DCIS和IDC在基因上相似，但在匹配的DCIS和IDC之间仍发现了一些质的差异。Kim等[39]通过全外显子组测序和拷贝数分析确定了从DCIS到IDC的相关基因组改变，该研究发现了一些已知的突变，包括肿瘤蛋白p53基因、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α以及蛋白激酶B1的突变和纯DCIS中拷贝数的改变；但与同步DCIS-IDC相比，检测到的基因突变与拷贝数的改变明显减少。此外，Song等[40]通过分析GSE21422和GSE3893基因表达综合数据集中DCIS和IDC的基因谱，探讨导致DCIS向IDC发展的基因改变，从中共鉴定出26个保守的差异表达基因，其中FCGR2A、主要组织相容性复合体-DRA、补体成分3a受体1和FYB参与了DCIS向IDC的进展，人类白细胞抗原-DRA和FYB水平升高与乳腺癌复发有关，且FYB的过度表达与乳腺癌转移有关。这些研究表明，至少在某些样本中，通过达尔文选择可能会发生从DCIS到IDC的进展。以上研究提高了人们对DCIS进展的认识，有助于识别潜在的进展标志物，寻求新的治疗目标，从而开发出一种更加个性化的DCIS患者治疗方法。

4 小 结

随着DCIS发病率的增加,病理工作者需要提供重要病理信息以指导DCIS患者的治疗决策，临床工作者也需要更好地了解DCIS发生、发展的分子机制，以帮助患者选择更好的治疗方法。从DCIS到IDC的进展是一个非常复杂的分子事件，深度大规模平行测序和单细胞分析不仅提供了基因信息，同时也提供了一个详细的关于肿瘤内和肿瘤间遗传异质性和肿瘤演变过程的基因图谱。目前，大规模平行测序的生物信息工具正在不断的改进，这将有助于从大块肿瘤群体测序中获得更加详细的信息，为识别体细胞的点突变提供更灵敏的方法。同时，研究发现了许多DCIS癌细胞中基因的改变、癌周环境的改变以及这些改变间的相互作用,这有助于更好地评估DCIS的发展,以期找出一个判断DCIS是否会发展为IDC的综合评定标准，从而指导临床工作。