乳腺癌中癌相关成纤维细胞的异质性、免疫调节及靶向治疗作用

钟凤梅，黄剑

(广东医科大学附属医院病理诊断与研究中心，广东 湛江 524001)

乳腺癌组织主要由肿瘤细胞及其周围肿瘤微环境构成，肿瘤微环境中富含多种异质性细胞群体，包括癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)、血管内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、免疫细胞以及干细胞等，肿瘤微环境为乳腺癌细胞的增殖提供了充足的生存空间及营养物质[1]。肿瘤微环境可维持肿瘤干细胞的特性，还可促进慢性炎症形成、肿瘤血管生成、侵袭和转移。CAFs是乳腺癌肿瘤微环境中的最主要成分，占50%～70%[2]，并作为肿瘤微环境中最丰富的间质细胞，通过分泌多种细胞因子、趋化因子、代谢物、蛋白酶以及细胞外基质蛋白等参与多种信号通路，实现与肿瘤细胞的相互作用，进而促进乳腺癌的发生、发展、浸润与转移。CAFs能分泌多种胶原蛋白和代谢酶，重构肿瘤间质，在癌巢周围形成致密坚实的物理屏障，阻断化疗和靶向药物杀死肿瘤细胞的作用。此外，CAFs分泌的多种免疫因子与免疫细胞相互作用，引起免疫微环境的改变，从而降低乳腺癌的治疗效果[3-4]。基于CAFs促进癌症的生长、调控及重塑肿瘤微环境等方面的重要作用，CAFs成为乳腺癌治疗的新靶点。现就乳腺癌中CAFs的异质性、免疫调节及潜在的CAFs靶向治疗作用予以综述。

1 CAFs的异质性

1971年，成肌纤维细胞在切口愈合中被首次识别，2006年被定义为可表达平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的活化的成纤维细胞，即CAFs，又称为肌成纤维细胞、肿瘤相关成纤维细胞、癌旁成纤维细胞或反应性成纤维细胞[5-6]。光学显微镜下CAFs的形态与正常成纤维细胞(normal fibroblasts，NFs)相似，呈圆形、椭圆形、纺锤形，细胞核不规则，含丰富的嗜碱性细胞质，常常出现在炎细胞浸润、黏液样变性或纤维化间质中，亦可包围肿瘤组织呈旋涡状排列，是形成乳腺癌间质反应的主要细胞成分。电子显微镜下CAFs细胞质中含大量的弹性纤维、游离核糖体、丰富的粗面内质网以及发达的高尔基体，细胞质外围可观察到纤维连接蛋白和肌丝[7]。与肿瘤细胞一样，CAFs具有高度异质性，常处于动态变化中。静息状态下，与结缔组织内NFs一样，CAFs负责合成细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，支持和构建组织骨架，并参与组织伤口修复和组织衰老的过程；激活状态下，CAFs迁移到肿瘤间质中，且容易转化，促进乳腺癌的发展[6]。因此，通常将CAFs视为肿瘤发生发展过程中的动态变化状态，而非独立的细胞群体。CAFs的异质性不仅体现在形态上，也体现在来源、亚群种类以及生物标志物等方面。

1.1CAFs来源的多样性 CAFs的来源主要有：①由肿瘤细胞分泌的多种因子激活肿瘤间质中静息态NFs产生，被认为是CAFs的重要来源，其机制可能是乳腺癌细胞通过旁分泌或自分泌的方式分泌某些生长因子或细胞因子[如转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β]作用于NFs，促进其分化为CAFs；②由CXC趋化因子配体16刺激骨髓来源干细胞分化产生，包括骨髓间充质干细胞和造血干细胞；③由乳腺癌上皮细胞通过上皮-间充质转化以及血管内皮细胞通过内皮-间充质转化产生；④由血管平滑肌细胞及周细胞转化而来；⑤由人脂肪源性干细胞转化而来；⑥肿瘤间质细胞内维生素A的缺乏导致间质细胞高表达α-SMA，诱导肿瘤间质细胞(如肝脏星形细胞)向CAFs转化[8]。

1.2CAFs亚群的多样性 在基因角度上，CAFs来源的多样性决定着其亚群的多样性，虽然目前无法确切识别和分离出CAFs的具体亚群和数量，但可以通过识别CAFs表面的某些分子标志物区分CAFs亚群，探讨其生物学功能。表达α-SMA的CAFs亚群与肌成纤维细胞具有相同的生物学特征，可引起细胞收缩迁移和基质蛋白分泌，并通过旁分泌与肿瘤细胞相互作用[9]；表达CD146的CAFs亚群可增加乳腺癌雌激素受体的表达，提高内分泌治疗的敏感性[10]；表达CD44的CAFs亚群可激活Hedgehog信号通路促进胰岛素样生长因子2的表达，引起紫杉醇耐药[11]；表达CD10和GPR77的CAFs亚群通过补体信号激活核因子κB维持肿瘤干细胞特性，促进乳腺癌耐药[12]；表达组织相容性复合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ和CD74的CAFs亚群参与调节T细胞的发育和启动[13]；表达程序性细胞死亡配体(programmed cell death-ligand，PD-L)1和PD-L2的CAFs亚群通过激活Toll样受体4 或γ干扰素信号通路，促进肿瘤细胞逃避免疫监视[14]。总之，CAFs作为肿瘤微环境中的异质性细胞群体，具有不同的子集和亚群以及不同的表型和功能，在恶性肿瘤进展中可起到抑癌或促癌的双重作用[15]。未来应从CAFs细胞、分子和功能方面区分CAFs亚群，细化CAFs分子标记组合，对不同组织肿瘤亚群和抗肿瘤亚群进行分类，鉴定出具有促进肿瘤特性的CAFs群体，通过识别某些特定的分子标记定义CAFs亚型，并了解它们的功能和机制。

1.3CAFs生物标志物多样性 CAFs生物学标志物的表达亦呈多样性。表达于CAFs，可用于评估肿瘤预后良好的标志物有成纤维细胞活化蛋白[16]、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)-2、MMP-9[17]等；可用于评估肿瘤预后不良的标志物有α-SMA(目前临床应用最广的标志物之一)、平足蛋白、成纤维细胞特异蛋白-1[18]、波形蛋白、细胞黏合素C[19]等。MHCⅡ是最近新发现的CAFs生物学标志物，可能与肿瘤的免疫调节有关[13]。虽然CAFs可来源于上皮细胞和血管内皮细胞，但CAFs均不表达上皮或内皮标志物，如细胞角蛋白、血小板内皮细胞黏附分子(CD31和CD34)。尽管这些CAFs标志物可用于预测人类乳腺癌的预后，但由于CAFs亚群的多样性，目前尚未发现可作为乳腺癌预后独立预测因子的具体特异性标志物类型。

2 CAFs对乳腺癌的免疫调节

乳腺癌的进展受到多因素的作用，不仅是单个肿瘤细胞的克隆性增殖，亦受肿瘤间质成分的影响以及肿瘤微环境中多种信号通路的调控，其中肿瘤细胞以细胞因子、趋化因子、生长因子、黏附分子为传递信号与CAFs进行信息交流，共同搭建动态网络——肿瘤微环境，并共同调控肿瘤微环境中的免疫应答反应[20-21]。

2.1CAFs对免疫细胞的调节 CAFs是免疫逃避的关键细胞。因其异质性以及功能的多样性，被认为CAFs可吸引间充质干细胞、髓源性抑制细胞、CD4+CD25+叉头框蛋白3+调节性T细胞等具有抑制T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)，介导各种免疫细胞亚群进入肿瘤微环境，并通过分泌某些细胞因子和(或)趋化因子抑制免疫细胞的功能，尤其是抑制调节性T细胞、细胞毒素T细胞、NK细胞、肿瘤相关巨噬细胞等免疫细胞的功能，促进乳腺癌的进展[21-22]。一方面，CAFs能够抑制效应T细胞的增殖，并通过分泌CXC趋化因子配体12，吸引CD4+CD25+T淋巴细胞进入肿瘤间质，将其转化为CD25+叉头框蛋白3+T细胞，引起三阴性乳腺癌肿瘤微环境出现免疫抑制，产生耐药；另一方面，CAFs可释放一氧化氮直接抑制CD4+CD8+T细胞的增殖，并通过分泌白细胞介素-4、白细胞介素-6等引起M2型巨噬细胞数量增多，进而抑制T细胞功能[3,20,23-24]。此外，CAFs吸引巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞等迁移到癌旁间质内，使其无法进入癌组织内发挥正常肿瘤免疫杀伤功能[4]。综上所述，CAFs可以不同方式改变肿瘤微环境中免疫细胞的免疫功能，影响免疫应答反应，导致免疫抑制。目前对CAFs在调节免疫细胞和免疫治疗反应的作用尚不明确，需要更多研究的确定。

2.2CAFs重构肿瘤间质 ECM重构以及肿瘤间质纤维组织增生是许多实体肿瘤的特征之一[25]。正常情况下，位于实质周围的正常间质细胞，通过分泌生长因子及骨架支撑作用维持正常组织结构的完整性。血管内皮细胞和周细胞可维持血管的完整性，保证组织中氧气和营养物质的输送，NFs则负责构建ECM，应对结缔组织内的机械压力；当肿瘤发生后，CAFs可分泌血管内皮生长因子，刺激生成丰富的肿瘤血管网，还可表达多种重构ECM物质，如Ⅰ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白、ⅩⅣ型胶原蛋白、MMP、金属肽酶以及重构ECM分子等[24]。异常血管的生成、胶原蛋白的沉积以及重构的ECM共同重建肿瘤间质，在癌巢周围形成坚硬致密的“围墙”，阻断了CD8+T细胞对肿瘤细胞的攻击[3,25]。CAFs产生大量的TGF-β诱导蛋白与其同源受体整合素β3相互作用，可抑制肿瘤特异性CD8+T细胞和F4/80巨噬细胞活化和增殖；CAFs产生的TGF-β诱导蛋白耗竭后，CD8+T细胞功能激活，进而抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡[26]。CAFs分泌的细胞黏合素C通过调节巨噬细胞吞噬胶质母细胞瘤细胞的能力以及刺激胶质母瘤细胞释放炎症刺激因子，影响肿瘤微环境中免疫细胞功能[27]。CAFs分泌的MMP不仅可降解正常ECM成分，还降低了NK细胞的活性。重构后的ECM可正反馈刺激间质内NFs转化为CAFs[26]。由此可见，CAFs是肿瘤间质重建的主要驱动者，参与肿瘤间质重建的免疫抑制信号分子的释放大多数由CAFs分泌，并引起免疫细胞功能的改变，调节肿瘤微环境中免疫细胞的浸润。

2.3肿瘤代谢产物调控CAFs 在乳腺癌肿瘤微环境中，肿瘤细胞和肿瘤间质细胞产生的代谢物的异常积累也可促进肿瘤细胞的生长和转移，促进免疫耐受和治疗耐药[28]。高代谢情况下，肿瘤细胞摄取葡萄糖增多，以致葡糖糖相对供应不足，肿瘤细胞发生糖酵解产生乳酸引起肿瘤微环境中CAFs分泌TGF-β，TGF-β的增多引起磷酸烯醇丙酮酸的缺乏，进一步抑制活化T细胞的功能，促进CD4+T细胞向辅助性T细胞2表型转化，促进肿瘤微环境中免疫抑制反应的形成[4,21]。此外，由CAFs产生的免疫调节代谢物R-2-羟戊二酸通过激活核因子κB信号通路参与免疫应答反应。

CAFs也是多种免疫调节代谢酶的主要来源，如环加氧酶-2、色氨酸2-3二氧酶等均可引起调节性T细胞数量增多，并抑制NK细胞、细胞毒性T细胞的功能[4]。最近研究发现，CAFs产生的代谢酶——烟酰胺N-甲基转移酶(nicotinamide N-methyltransferase，NNMT)是CAFs参与肿瘤性ECM分泌全过程的主要代谢调节剂，NNMT蓄积导致S-腺苷蛋氨酸的耗竭和组蛋白甲基化的减少，而组蛋白甲基化与肿瘤间质中广泛基因突变有关[29]。NNMT可改变卵巢高级别浆液性癌的肿瘤微环境，促进卵巢高级别浆液性癌的转移，但NNMT在乳腺癌进展及肿瘤免疫微环境改变中的作用还需要更多研究的证实。

2.4表面分子调控CAFs 正常情况下，NFs可表达MHCⅠ，但抗原呈递CAFs可表达MHCⅡ表面分子，在肿瘤相关抗原刺激下，可诱导CD4+T细胞功能衰竭，影响肿瘤免疫微环境。目前，以MHCⅡ表面分子为调控媒介，CAFs与相关抗原呈递作用的确切位点尚不清楚。某些CAFs亚群可表达激活Toll样受体4或γ干扰素信号通路的PD-L1、PD-L2，支持肿瘤细胞进行免疫逃避。研究显示，表面分子肿瘤坏死因子超家族成员中，共刺激分子OX40及其配体OX40L可通过OX40/OX40L信号通路激活记忆CD4+T细胞的功能，诱导CD4+CD25+T细胞进入乳腺癌肿瘤微环境中。此外，其他CAFs表面分子如双肽肽酶4、连接黏附分子2、免疫检查点B7-H3、钙粘连蛋白11等亦可通过介导免疫细胞迁移、增殖、分化，促进肿瘤微环境形成免疫逃逸[4,23]。

3 CAFs为乳腺癌潜在治疗靶点

在乳腺癌治疗中，放疗、化疗、靶向药物治疗均通过阻断或激活某些信号通路直接抑制肿瘤细胞的增殖。CAFs作为乳腺癌肿瘤微环境中调节免疫应答反应的关键细胞，可促进肿瘤细胞逃避免疫监视，形成免疫抑制微环境。仅针对肿瘤细胞治疗乳腺癌的疗效较局限，针对CAFs靶向治疗结合肿瘤微环境，采用综合性乳腺癌治疗方案是更有效的乳腺癌治疗途径。目前，可能有效的乳腺癌潜在靶向CAFs疗法有：①逆转CAFs促瘤表型成抑瘤表型；②靶向CAFs表面蛋白；③靶向促瘤型CAFs的分泌因子、趋化因子；④靶向促瘤CAFs亚群；⑤抑制CAFs的激活；⑥逆转CAFs成NFs[30]；⑦靶向CAFs分泌的免疫因子，恢复肿瘤微环境中NK细胞和CD8+T细胞的免疫功能[31]。基于上述理论基础，一部分靶向CAFs药物正在研发中。靶向CAFs表面的膜结合酶成纤维细胞活化蛋白可显著抑制肿瘤细胞的生长；利用肾素-血管紧张素抑制剂可干扰CAFs介导的TGF-β信号通路，减轻免疫抑制反应并提高T细胞的细胞毒性，从而显著提高乳腺癌的免疫治疗效果[32]。然而，由于CAFs处于动态变化中，消除CAFs有时反而加速了疾病的进展，如消除CAFs可使胰腺癌出现免疫抑制，导致患者生存期缩短[33]。可见，CAFs具有促瘤和抑瘤双重功能，需要选择性消除促瘤CAFs亚群，保留抑瘤CAFs亚群，阻止肿瘤细胞免疫逃逸，增加癌巢中免疫细胞的浸润数量，从而发挥细胞毒性功能。

4 小 结

CAFs是肿瘤微环境中具有高度异质性和强大可塑性的间质细胞群，兼具促瘤、抑瘤双相功能，通过调节乳腺癌肿瘤微环境中免疫细胞功能、重构肿瘤间质、以肿瘤代谢产物及表面分子为媒介影响肿瘤免疫微环境，协助癌细胞实现免疫逃逸，引起乳腺癌进展。因此，基于CAFs在免疫抑制中发挥的关键作用，CAFs可作为增强乳腺癌免疫治疗的新靶点。靶向CAFs对恢复免疫监测、逆转肿瘤免疫抑制微环境，治疗乳腺癌尤为重要。但是，由于CAFs的生物学特性多样，CAFs靶向药物的研发较复杂，未来对乳腺癌个体化、多元化治疗的研究多集中于CAFs靶向治疗，可提高乳腺癌化学敏感性、增强机体免疫细胞功能、减少抑制免疫信号通路的激活，对于预防性干预肿瘤免疫抑制微环境的形成，最大限度地提高乳腺癌免疫治疗的疗效具有重要意义。