粪便基因甲基化检测在结直肠癌早期诊断中的研究进展

徐正，颜宏利

(1.海军军医大学附属长海医院生殖医学中心，上海 200433； 2.上海中医药大学附属第七人民医院检验科，上海 200137)

结直肠癌的患病率居全世界恶性肿瘤的第三位，是第四大常见癌症相关死亡原因，每年死亡病例数约70万[1]。自20世纪80年代以来，美国结直肠癌的病死率呈下降趋势，主要归因于不断完善的筛查模式和先进的治疗水平；而由于饮食和生活方式的影响，我国结直肠癌的发病率呈上升趋势，城市高于农村，结直肠癌患病率在男性和女性恶性肿瘤患病率中分别位于第五位和第四位，仅次于肺癌、支气管癌、胃癌和乳腺癌[2]。临床研究显示，手术基本可以治愈结直肠早期异型增生息肉、腺瘤患者，但手术治疗Ⅲ、Ⅳ期结直肠癌患者的治愈率不足10%，临床大多数结直肠癌患者确诊时已是中晚期[3]。早期结直肠癌缺乏典型临床症状，因此，寻找早期有效的结直肠癌诊断方法可降低结直肠癌患病率和相关病死率，对早发现、早治疗、改善患者生活质量、提高患者生存率具有重大意义。近年来，对大多数新型潜在结直肠癌生物标志物的研究主要集中于粪便DNA的分析，目前确定的参与早期结直肠癌和癌前病变的3种主要遗传机制为：①由APC、KRAS和TP53基因突变引起的染色体不稳定性；②由错配修复基因功能丧失导致的微卫星不稳定性；③DNA甲基化(一种表观遗传改变)导致启动子高甲基化并抑制随后的基因转录[4]。早期对粪便DNA(KRAS等)突变和微卫星不稳定性的研究未取得预期的效果，近年来大多数研究集中于对粪便甲基化基因的研究。现就粪便基因甲基化检测在结直肠癌早期诊断中的研究进展予以综述。

1 筛查方法

目前，临床筛查结直肠癌的主要手段有粪便隐血试验和结直肠镜检查。粪便隐血试验是早期结直肠癌筛查的简便方法，人群筛查参与率高，但其检出癌前病变和结直肠癌的敏感性较低，需要多次重复测试，且干扰因素多，难以满足临床诊断的要求。病理检查是确诊结直肠癌的“金标准”，具有良好的诊断性能，结直肠镜检查有助于检测和治疗结直肠癌前病变，检查前需要充分清洁肠道，但检查的不适感导致患者依从性下降，并且操作时出现出血和穿孔等并发症的风险较高，难以作为早期筛查方法大规模开展，因此临床迫切需要寻找一种新的非侵入性的敏感性、特异性较高的结直肠癌筛查方法。

2 粪便DNA甲基化检测

结直肠细胞更新速度较快，正常人每天结直肠脱落细胞约有1010个，与正常大肠黏膜相比，结直肠癌时大肠黏膜的脱落细胞数量更多，因此通过分析粪便脱落癌细胞和游离DNA甲基化的状况可进行有效的大肠癌筛查[5]。目前已知多个粪便DNA超甲基化检测标志物。

2.1DNA甲基化 DNA甲基化是指CpG位点(胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤位点，即DNA序列中胞嘧啶后紧连鸟嘌呤的位点)在DNA甲基转移酶催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体将胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶[6]。DNA甲基化修饰导致基因长期处于沉默状态，表达功能丧失，许多抑癌基因甲基化引起了肿瘤的发生、逃逸和转移。正常人抑癌基因CpG岛(人类基因组中碱基CG序列出现频率较高的区域)内CpG序列为低甲基化状态，而在结直肠癌肿瘤患者基因组中，启动子区域CpG岛表现为高甲基化状态，可抑制基因转录，进而阻断正常基因表达。越来越多的研究表明，甲基化介导的肿瘤抑制基因沉默有助于结直肠癌的发生和发展[7]，结直肠癌的大量异常甲基化基因启动子区域具有多种生物学控制功能，如基因组稳定性，细胞增殖和运动性。

2.2单基因甲基化检测

2.2.1分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein，SFRP)2 SFRP是一类分泌蛋白，可以结合Wnt配体和卷曲受体。SFPR甲基化后，Wnt信号途径激活，进而导致蛋白质功能异常，促进了癌细胞的增殖，最终导致肿瘤的发生和发展。结直肠癌中SFRP基因甲基化可激活Wnt信号通路，并促进细胞抵抗凋亡，Wnt信号通路的激活在整个结直肠癌进展过程中持续存在。SFRP2是SFRP家族成员之一，可在结直肠癌细胞中高度甲基化。Müller等[8]的研究指出，运用MethyLight方法分析SFRP2基因的超甲基化可检测出粪便样品中SFRP2基因的高甲基化，从而诊断结直肠癌，其灵敏度和特异度分别为90%和77%，可见SFRP2基因检测结直肠癌的敏感性极好。Lu等[9]运用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)检测56例结直肠癌患者和40例健康者粪便标本SFRP2甲基化情况，结果显示，SFRP2基因在结直肠癌中高度甲基化57.1%(32/56)，健康对照组粪便标本中只检测出4例SFRP2基因甲基化，检测的特异度为90%。Babaei等[10]的研究亦表明，SFRP2基因检测结直肠癌的灵敏度和特异度分别为60%和92%，因此，对粪便SFRP2基因异常甲基化的检测可能成为具有应用前景的非侵入性结直肠癌筛查方法。

2.2.2肿瘤高甲基化1(hypermethylated in cancer 1，HIC-1)基因 HIC-1基因是一种肿瘤抑制基因，位于第17号端粒染色体区域p13.3位点，可调节多个正常和肿瘤细胞系的细胞增殖、存活和生长停滞[11]。HIC-1基因可在大部分正常组织中表达，由于甲基化的影响，其在肝癌、结直肠癌等细胞的表达下降，并可在某些肿瘤的早期阶段即发生甲基化，在肿瘤的发展及预后中起重要作用。Abouzeid等[12]对肿瘤抑制基因(RASSF1A、MGMT和HIC-1)在结直肠黏膜癌和癌前病变中甲基化状态的研究显示，溃疡性结肠炎患者的HIC-1基因甲基化频率最高(57.8%)。Lenhard等[13]采用MSP法对粪便标本HIC-1基因启动子甲基化状态进行盲法分析显示，42%的结直肠癌患者和31%的腺瘤患者的HIC-1启动子甲基化呈阳性；而内镜下正常结肠或增生性息肉患者粪便中未检测到甲基化HIC-1启动子，可见，表观遗传标记HIC-1启动子甲基化具有检测结直肠癌的潜力，可能成为结直肠肿瘤早期筛查的分子标志物。

2.2.3波形蛋白 波形蛋白是蛋白质中间丝家族的主要成分，在正常间质细胞中普遍表达，可维持细胞完整性，被认为是上皮-间充质转化的标志。波形蛋白基因启动子区域异常甲基化可能有助于结直肠细胞癌变。粪便波形蛋白基因启动子甲基化也是敏感和特异的结直肠癌筛查指标。Chen等[14]研究显示，通过粪便DNA波形蛋白甲基化异常检测结直肠癌的灵敏度为46%(95%CI35%～56%)；检测Ⅰ、Ⅱ期结直肠癌的灵敏度为43%(26/60)(95%CI31%～57%)，仅10%(20/198)无癌个体的对照粪便DNA样本波形蛋白甲基化检测呈阳性，特异度为90%(95%CI85%～94%)。Lu等[9]应用MSP分析56例结直肠癌患者和40份结肠镜检查正常者粪便DNA中波形蛋白等多个基因启动子CpG岛甲基化的研究显示，结直肠癌患者波形蛋白基因启动子甲基化水平为41.1%(23/56)，该基因的特异度为85.0%(6/40)。Xiao等[15]运用甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析技术检测结直肠癌和进展期腺瘤的波形蛋白基因甲基化状况发现，结直肠癌的甲基化率为92.5%(37/40)，进展期腺瘤的甲基化率为94.4%(34/36)，正常对照组的甲基化率为8.8%(5/57)，故认为波形蛋白基因甲基化检测可作为具有较好检测性能的结直肠癌早期筛查方法。

2.2.4N-Myc下游调节基因4(N-Myc downstreem-regulated gene 4，NDRG4) NDRG4位于染色体16q21-22.1上，含有17个外显子和16个内含子，是N-myc下游调节基因家族的成员，在多种正常人体组织中高表达，在某些肿瘤组织中不表达或低表达，低表达可能与启动子高甲基化有关。NDRG4作为肿瘤抑制基因，其5′端调控区域含有CpG岛，在结直肠癌发生发展过程中常被甲基化。Melotte等[16]应用MSP法检测结直肠癌患者和健康对照人群粪便NDRG4启动子甲基化的研究发现，粪便NDRG4启动子甲基化分析检测结直肠癌的灵敏度为61%，特异度为93%。Xiao等[17]采用巢式MSP和变性高效液相色谱法成功检测了84例结直肠癌组织、癌旁组织、粪便、血液和尿液中NDRG4基因的甲基化表达，并对甲基化NDRG4基因作为大肠癌生物标志物的敏感性和特异性进行分析发现，甲基化NDRG4基因在癌组织、癌旁组织、血液、尿液、粪便中的阳性检出率分别为81%、8.3%、54.8%、72.6%和76.2%；与16名年龄相仿健康对照人群相比，粪便甲基化NDRG4检测结直肠癌的灵敏度、特异度均较高，且粪便样本的收集较简便，故粪便甲基化NDRG4检测有望成为结直肠癌早期诊断的生物标志物。

2.2.5组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2，TFPI-2) TFPI-2是Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员，抑制组织因子/因子Ⅶa复合物和各种丝氨酸蛋白酶，可维持肿瘤细胞环境的稳定性、抑制肿瘤细胞侵袭和转移、诱导细胞凋亡等功能[18]。肿瘤细胞的发生和发展与TFPI-2基因CpG岛的异常甲基化使TFPI-2表达降低或缺失有关。结直肠癌患者粪便TFPI-2甲基化的灵敏度和特异度较高，TFPI-2基因启动子检测结直肠癌患者粪便甲基化的灵敏度和特异度分别为76%～89%和79%～93%[19-20]。

2.2.6O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT) MGMT是一种DNA修复基因，位于染色体10q26上，编码DNA修复蛋白O6-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶，并可逆转烷化剂对DNA的复制与突变的损伤。Meta分析提示，结直肠癌患者的MGMT甲基化频率显著上升，并且MGMT基因启动子的甲基化涉及结直肠癌的逐步癌变过程。Baek等[21]运用MSP检测粪便样品MGMT基因甲基化状况的研究显示，结直肠癌的检出率为51.7%，结直肠腺瘤的检出率为36.5%，特异度为86.5%。康燕平等[22]对粪便样本的甲基化检测显示，结直肠癌、结肠腺瘤、增生性息肉的MGMT甲基化频率分别为55.1%、37.5%、10.5%，因此，MGMT可作为结直肠癌和癌前病变的无创筛查分子标志物。

此外，对结直肠癌或癌前病变患者粪便基因(硫酸类肝素蛋白多糖2基因、分泌型卷曲相关蛋白2基因、Y染色体性别决定区域相关高迁移率族盒21基因、抑瘤素M受体基因、痉挛性截瘫-20基因、GATA结合蛋白4基因、Septin9基因、p33ING1b基因等)甲基化状态检测的诊断效能亦较好，故也可作为筛查标志物用于结直肠癌的早期诊断[23-30]。

2.3多基因联合检测 结直肠肿瘤发生发展过程中受到多种基因的调控，应用单一基因诊断较局限，为了提高检测灵敏度常对多个甲基化基因进行联合检测。Zhang等[31]采用MSP法分析结直肠癌、结直肠腺瘤、增生性息肉以及健康者粪便标本中SFRP2和WIF-1基因启动子的甲基化状态发现，至少一种高甲基化基因检测结直肠癌和结直肠腺瘤的检出率分别为81.3%(39/48)和65.7%(23/35)，其中仅1名健康者粪便样本中检测出高甲基化WIF-1基因，特异度为97%。肖著军等[32]应用MSP法检测病例组(40例大肠癌患者、25例进展期腺瘤患者)和正常组(30例结肠镜阴性正常人)粪便的Vimentin和SFRP2的甲基化状态，并与单个基因甲基化检测的诊断性能进行比较发现，两基因联合检测组的灵敏度(83.1%)明显高于单纯Vimentin(52.3%)以及SFRP2(67.7%)，表明在大肠癌筛查中，联合检测粪便Vimentin和SFRP2基因甲基化状态优于单个基因检测，具有潜在的应用价值。Ahlquist等[7]采用波形蛋白、NDRG4、BMP3和TFPI2联合检测筛查出85%的结直肠癌和54%的腺瘤大小≥1 cm的结直肠腺瘤患者，检测特异度为90%，且对Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌的检出率为87%。Imperiale等[33]对9 989名参与者运用多靶点DNA测试板(包括KRAS突变，NDRG4、BMP3基因甲基化、β-肌动蛋白以及血红蛋白免疫测定)进行评估，鉴定出结直肠癌患者65例(0.7%)，晚期癌前病变(晚期腺瘤或无柄锯齿状息肉，最大病灶直径≥1 cm)患者757例(7.6%)。 粪便DNA检测检出结直肠癌的灵敏度为92.3%，检出晚期癌前病变的灵敏度为42.4%，检出高级别不典型增生息肉的灵敏度为69.2%，DNA检测的特异度为86.6%。基于Imperiale[33]的研究，美国食品药物管理局在2014年批准了Cologuard®试剂(Exact Sciences Corporation，Madison，WI，美国)用于结直肠癌的早期筛查，由此可见，联合检测较单基因检测及其他粪便检测的诊断效能更高。DNA高甲基化与结直肠肿瘤的发生发展关系密切，对新的具有潜力的甲基化基因SLC6A15、NPY、GRASP、ST8SIA1和ZSCAN18、MAPK14、MAPK3、HRAS、YY1、IRF4的研究正在进行中[34-35]。

3 现状以及存在的问题

目前，血浆Septin9基因甲基化检测商业试剂盒已应用于结直肠癌临床辅助诊断，新的具有潜力的甲基化基因SLC6A15、NPY、GRASP、ST8SIA1和ZSCAN18、MAPK14、MAPK3、HRAS、YY1、IRF4的研究也在进行中[34-35]。基于粪便基因甲基化检测的标志物还面临以下主要问题：①缺乏理想的粪便DNA甲基化基因。与结直肠癌相关的甲基化基因较多，单个或多个基因组合诊断结直肠癌和晚期结直肠腺瘤的灵敏度和特异度不一，寻找灵敏度和特异度较高的单个或复合的甲基化基因是研究的重点和难点。②直接提取粪便DNA时，易造成细菌等其他DNA污染以及DNA提取量不足的情况，需要创新粪便脱落细胞分离技术，建立简便、标准化、特异性高的肿瘤细胞分离收集方法，以提高检测的敏感性和特异性。③需要改进和标准化甲基化检测方法的灵敏度。统计分析结果显示，结直肠癌患者粪便中单基因甲基化检测的敏感性存在偏倚，可能与研究对象的种族、性别、样本数量以及甲基化检测方法的不同有关[36]。④不典型增生性腺瘤是最常见的结直肠癌癌前病变，其发展为结直肠癌的病程往往在10年以上，可见不典型增生性腺瘤的早期检测十分重要，但目前研究仍集中于对恶性肿瘤敏感的标志物，开发更多对癌前腺瘤组织敏感和特异的甲基化指标是未来的研究方向和研究重点。

4 小 结

从结直肠癌的发生发展过程来看，由不典型增生性结直肠息肉发展到恶性结直肠腺癌是遗传学和表观遗传学改变共同作用积累的过程，存在多种癌基因激活和抑癌基因失活的参与，其中基因启动子区域的甲基化可导致抑癌基因失活，且在肿瘤发生早期已出现，故抑癌基因甲基化检测有助于结直肠癌的早期诊断以及肿瘤发展、转移和预后的评估，对指导临床诊疗工作具有重要意义。粪便脱落细胞DNA甲基化检测作为全新的无创筛查模式对诊断结直肠癌、评估患者预后、监测病情发展等具有潜在价值。随着检测技术的发展及分子生物学研究的深入，粪便DNA甲基化检测在癌前病变监测和结直肠癌早期诊断方面具有广阔的应用前景，将成为结直肠癌早期诊断、早期治疗和预后判断的新型标志物。