东北林蛙油研究进展

张 傲 张 悦 陈 缘 翁 强 许美玉

北京林业大学生物科学与技术学院，北京100083

东北林蛙（Rana dybowskii），又称雪蛤、哈什蟆、田鸡，属于两栖纲无尾目蛙科林蛙属中国林蛙种，主要产于黑龙江、辽宁、吉林3 省，其中尤以吉林省长白山区域分布居多，为我国特有的国家二级保护动物，也是一种珍贵的野生经济动物[1-2]。由于近年来过度捕捉和自然环境的破坏，东北林蛙的野生资源正日益减少，已被《中国濒危动物红皮书》列为易危（V）物种[3]。雌性东北林蛙冬眠前膨大的输卵管干制品被称为林蛙油（oviductus ranae），俗称蛤蟆油、雪蛤油、哈什蟆油，号称“绿色软黄金”，是我国名贵的中药和传统的保健食品。林蛙油具有补肾益精、健脾益胃、滋阴补肾、润肺生津等功效[4]。现代研究还表明，林蛙油具有明显抗疲劳、抗衰老、抗氧化、调节人体内分泌等保健作用[5-6]。正是由于东北林蛙油的多重药用和保健功能，其被收录于《中华人民共和国药典（2015 版）》。近年来，尽管东北林蛙养殖已成为广大农林水产养殖户增收致富的手段，但却始终存在着对野生林蛙珍品进行掠夺式捕杀、人工养殖技术尚未完全成熟、基础研究和林蛙油利用产业化发展不平衡等问题。为了更好地利用东北林蛙资源，提高林蛙油产量以满足市场需求，亟待需要对林蛙油形成机制进行深入研究。为此，本文拟就东北林蛙油的化学成分和药用价值、东北林蛙输卵管的组织解剖结构、激素与东北林蛙输卵管膨大的关系以及目前林蛙油形成机制研究过程中存在的问题与展望进行综述，期望为进一步深入研究林蛙油形成机制提供参考。

1 林蛙油的化学成分和药用价值

东北林蛙油中富含丰富的蛋白质，其粗蛋白质的含量达50%以上，且氨基酸种类齐全[7]。同时林蛙油中含有多种微量元素，尤其是钙、铁、锌、铬含量较高[5]。在林蛙油所含维生素和生理活性物质中，以维生素E、雌二醇、睾酮、孕酮和绒毛膜促性腺激素含量较多[8]。林蛙油中不饱和脂肪酸含量较高，占脂肪酸总量的40%左右，其中人体必需脂肪酸亚麻酸和亚油酸含量尤为突出[9]。林蛙油中含有的多种不饱和脂肪酸可以作为前列腺素合成必需的前体，因此具有防止血栓形成的作用[10]。另外，林蛙油中的核酸小分子能够被皮肤细胞吸收，使细胞更新速度加快，能抵抗紫外线伤害，防止皮肤癌变[11]。许会静等[12]的研究表明林蛙油可调节体内激素平衡，能够改善头晕、乏力等症状，具有改善大鼠酒精性肝纤维化的作用。金香男等[13]通过药理试验证明林蛙油对哮喘模型小鼠具有显著的镇咳、祛痰作用。研究还发现，林蛙油通过减少丙二醛（MDA）和蛋白质羰基（PCO）的形成，以及增加总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和谷胱甘肽（GSH）的合成发挥抗氧化的作用。除此之外，林蛙油的蛋白水解物能够抑制肝癌细胞的生长、转移和糖酵解，可能是潜在的有效抗肿瘤剂[14]。不仅如此，东北林蛙油还能够提高机体的非特异性免疫功能，增强体液免疫功能，促进成骨细胞生长，具有抗骨质疏松的作用[15-17]。

2 林蛙输卵管组织解剖结构研究

林蛙油是林蛙冬眠前膨大的输卵管组织。目前，关于东北林蛙输卵管组织解剖结构的研究主要集中在输卵管组织形态学和显微结构观察。在形态学方面，黄贺等[18]观察到东北林蛙输卵管为一对弯曲的长管，上端细，下端粗，颜色乳白，具有油质光泽，有特殊油脂香气。翁冀[19]对雌性东北林蛙进行解剖研究，发现东北林蛙输卵管上端开口于肺泡附近体腔处，下端至泄殖腔；输卵管管径较为均一，触摸有滑腻感，输卵管的重量、结构形态具有显著季节性变化的特点，即冬眠前的东北林蛙输卵管重量、管径等显著高于包括繁殖期在内的其他季节时期[20]。刘豫宁[21]对东北林蛙输卵管的显微结构进行观察研究，发现黏膜上皮细胞在输卵管内腔表面排列紧密，存在无纤毛的杯状细胞与有纤毛的上皮细胞；管状腺呈楔形或椭圆形排列，由腺细胞组成。腺细胞呈长方形，直径为25～75 μm，其细胞核位于细胞中间或略偏向细胞内腔一侧[22]。刘豫宁[21]还发现，东北林蛙输卵管的显微结构具有季节性变化特点。繁殖期东北林蛙输卵管纤毛发达，以纤毛上皮细胞为主，固有层具有分泌活跃的腺体，在排空的腺体中，腺腔大而明显。然而，冬眠前期东北林蛙输卵管上皮细胞纤毛不发达，以杯状细胞为主，管状腺体积增大，腺细胞核被挤压在腺细胞底部，管状腺开口不清晰，看不到腺腔[21]。在相同显微倍数观察下，冬眠前期的林蛙输卵管上皮细胞和固有层腺细胞体积均显著大于繁殖期，东北林蛙输卵管腺细胞和上皮细胞具有较高的增殖与分化，符合在冬眠前期林蛙输卵管膨大形成林蛙油的实际情况。

3 激素在东北林蛙输卵管膨大形成蛙油过程中的作用

3.1 东北林蛙输卵管中的性激素研究

目前关于东北林蛙输卵管中激素成分研究较少，主要集中在性激素的研究上。林蛙油中含有雌二醇、孕酮及雌三醇等甾体类雌激素，其中雌二醇最为常见。国内对雌二醇成分的研究也相对较多。李坚等[23]利用高效液相色谱法（HPLC）测定了不同产地林蛙油中雌二醇的含量，其中东北林蛙输卵管中雌二醇的含量为0.301 5 mg/g。王哲等[24]使用气相色谱－质谱联用方法，测得林蛙油中雌二醇含量为52.3±5.8 pg/100 mg，睾酮浓度为52.3±5.89 pg/100 mg，孕酮的含量为9 187.9±19.44 pg/100 mg。翁冀等[19,25]的研究表明，东北林蛙输卵管中存在雌激素合成酶P450arom 和雌激素及其受体，表明东北林蛙输卵管自身不仅拥有合成雌激素的能力，而且东北林蛙输卵管也是雌激素作用的靶细胞，雌激素能够通过自分泌或旁分泌对东北林蛙输卵管发挥重要作用。

3.2 性激素与林蛙输卵管膨大形成蛙油的关系

雌激素作为动物体内的一种重要生殖激素，在刺激雌性生殖器官的发育，维持其功能方面起着重要的作用[26]。P450arom 可以将雄激素芳香化成雌激素，是雌激素合成的关键酶，而雌激素主要通过其2个受体（ERα 和ERβ）介导来发挥其生物学作用[27]。研究表明，冬眠前的东北林蛙膨大的输卵管中的雌二醇含量相对较高[19]，雌激素合成酶P450arom 和雌激素受体ERα 的表达水平也显著高于其他季节时期[25]，增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和原癌基因c-kit也在这一时期的林蛙输卵管组织中具有较高水平的表达[16]，提示雌激素是直接刺激林蛙输卵管细胞增殖、分化成林蛙油的重要因素。另外，有研究表明，冬眠前的林蛙输卵管脂质含量极其丰富。刘豫宁[21]研究发现，繁殖期东北林蛙输卵管中的脂联素表达量多于冬眠前期的表达量，这与脂联素和受体相结合后，调节脂肪细胞的脂质分解这一观点是一致的。并且Xi 等[28]的研究也表明瘦素参与调节东北林蛙输卵管发育的过程，瘦素可能直接作用到输卵管的黏膜固有层组织上，通过自分泌或旁分泌机制调节东北林蛙输卵管的发育。尽管前人在林蛙蛙油中激素的季节性表达方面已取得一定的进展，但目前对东北林蛙冬眠前期输卵管特异膨大形成蛙油的分子机制尚不清楚，调控东北林蛙输卵管形成林蛙油的关键基因等方面还存在空白。

4 林蛙输卵管中的免疫调节因子表达研究

东北林蛙输卵管中具有丰富的免疫调节因子，其中前列腺素（prostaglandin，PG）为比较重要的一类免疫调节因子，具有多种生理作用。肖井雷等[29]利用气相色谱- 质谱联用（GC-MS）的方法，测定林蛙油中前列腺素的含量为0.35%。曹擎[30]通过分子生物学实验发现，冬眠前的东北林蛙输卵管中的前列腺素E2、前列腺素E2 受体EP4 以及环氧合酶-2均具有较高的表达，三者的表达量均高于繁殖期。此外，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）也在东北林蛙输卵管中被检测到，提示IL-6 和TNF-α在冬眠前东北林蛙输卵管的膨大中可能发挥了作用[31]。另外，在东北林蛙输卵管中检测到Toll 样受体2（TLR2）和Toll 样受体4（TLR4）有阳性表达，提示林蛙油的免疫功能是通过TLRs 下游信号通路来调控，促进免疫细胞的增殖与分化。同时，在东北林蛙输卵管中还检测到髓样分化因子88（MyD88）的较高表达（高于繁殖期），MyD88 也具有促进细胞增殖的功能，推测MyD88 可能在东北林蛙输卵管膨大过程中也发挥作用[31]。

5 林蛙油形成机制研究过程中发现的问题与展望

5.1 发现的问题

1）成本高昂资源稀缺。东北地区特别是长白山区域的东北林蛙为药用的历史悠久，林蛙油在国际保健食品资源市场上享有盛誉，价格昂贵，资源极为稀缺。近些年来，由于人为因素导致生态环境恶化，部分人为了牟利而大肆捕捉，以至于东北林蛙部分野生品种濒临灭绝[32]，现在已经被列为国家二级野生保护动物，这使得对林蛙油研究的成本大大提高，严重阻碍了林蛙油形成机理的研究。

2）国家对林蛙油相关研究支持力度不足。林蛙油具有良好的保健功效和丰富的营养成分，其营养和药用价值正在被逐步发现和证实，具有广阔的市场前景。但目前国家对林蛙油相关研究的支持力度却比较弱。据统计，到2018 年为止被国家自然科学基金委立项的项目中与林蛙研究相关的只有东北林业大学研究的“微生物胁迫下东北林蛙皮肤活性肽选择性表达的研究”项目。还没有出现与林蛙油相关的研究项目，这也在一定程度上影响了林蛙油形成机制的研究进展。

5.2 展 望

1）林蛙油资源的减少成为推动研究的巨大动力。林蛙油因其显著的保健功效、丰富的营养成分和药用价值，具有广阔的市场前景。然而，随着生态环境的破坏和大肆捕杀，野生林蛙油资源大量减少。与此同时，目前人工养殖的饲养技术尚不成熟，不能有效解决供需不匹配的问题，不能满足市场的需要，这与人们对林蛙油越来越大的需求之间存在着巨大的矛盾。因此，开展对林蛙油形成机制的深入研究，为满足人们对林蛙油日益增大的需求具有重要意义。

2）新技术的利用加快林蛙油形成机制的研究进展。近几年，生物科学技术的飞速发展，动物源药的显著疗效引起人们的关注和重视。酶工程技术、细胞工程技术、基因工程技术以及现代细胞分离技术等新技术、新方法的兴起和应用为林蛙油形成机制研究的进展创造了新的机会，能在一定程度上推动对林蛙油形成机制研究的进步。例如，利用全基因组测序及荧光定量技术等方法，可找到与林蛙油形成相关的基因。此外，同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技术等方法也能为开展林蛙油形成机制研究提供技术支撑[33]。随着生物新技术的进一步发展，林蛙油在临床、科研、药用和食品等产业上将有更加宽广的应用前景。

综上所述，我国目前对林蛙油形成机制的研究尚处于初期阶段，但随着人们对林蛙油保健价值认识的不断深入和其经济效益的不断提高以及大量新技术新方法的应用，林蛙油形成机制的研究将会有新的突破，人类会将科研成果迅速转化为生产力，更有效地利用东北林蛙资源，挖掘出其潜在价值，进而促进林蛙产业的发展，使之带来巨大的经济效益和社会效益。