手术中一种新的细胞治疗方法——内皮祖细胞

李 洁 李 萍 阎春生 哈小琴

1963年，首次报道血液中可能存在内皮细胞，而后在心脏移植患者的冠状动脉内壁发现了受体来源的内皮细胞，提示受体血液中的内皮细胞定居于移植物并参与血管壁的构建，再次证明移植物表面存在内皮细胞，而这些内皮细胞只可能来源于血液。1997年，Asahara等[1]首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞,并称之为血管内皮祖细胞。内皮祖细胞来源于骨髓,它们进入循环血,在血管移植物上分化为内皮细胞[2]。内皮祖细胞是在缺氧等病理条件下从骨髓中募集的，在缺血组织的新生血管形成中发挥至关重要的作用。目前已经建立了两种主要的EPCs亚型：所谓的“早期”EPCs(随后称为早期EPCs)和后期衍生的EPCs(晚期EPCs)[3]。在体外培养过程中，根据其生物学特性和外观可对其进行分类。“早期”EPCs出现在外周血来源的单核细胞在内皮细胞特异性培养基中培养后不到1周，而在2～3周后可以发现晚期的EPCs。晚期EPCs被认为主要是通过其分化成成熟内皮细胞的能力直接参与新生血管的形成，而早期EPCs将各种血管生成因子表达为内源性货物，以旁分泌的方式促进血管生成，在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)过程中，各种因素控制EPCs向血管形成区域的归巢。

EPCs在人血液中循环，具有分化为内皮细胞的能力，它们参与血管生成，能够以各种方式将炎症和缺血/再灌注损伤(I/R)造成的损害降到最低[4]。例如，EPCs显示细胞内过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶或锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutases, MnSOD)等抗氧化酶水平升高。抗氧化应激能力的增强使EPCs能够在缺血损伤后活性氧(reactive oxygen species, ROS)升高的微环境中发挥作用。EPCs的数量可能与血管修复有关，循环EPCs数量的减少预示着心血管事件的发生。然而，EPCs的明确定义还没有找到,到目前为止，EPCs还没有特异性的细胞表面标记或一致的表型，这些细胞在外周血中非常罕见。另外，EPCs主要受HIF-1、VEGF、SDF等多种细胞因子的动员归巢至特定部位并入血管内皮，受多种信号系统的调节进行分化完成血管新生[5]。各种治疗手段亦会影响血EPCs水平的改变。研究不同治疗手段对EPCs的影响不仅可以预测患者治疗后的转归而且可以指导制定联合治疗策略，掌握不同治疗手段对EPCs的不同影响，有助于权衡联合治疗方案。

一、内皮组细胞与经皮冠状动脉介入治疗术

EPCs在心血管系统和经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention, PCI)术后冠状动脉再狭窄的病理生理学中的作用是有争议的。尽管研究描述了EPCs在动脉粥样硬化过程中的保护作用，但在再狭窄中，EPCs、内皮修复和诱导新内膜增殖之间存在复杂的关系，因此，尚不清楚EPCs在这种情况下是否具有有益或有害的影响，有研究者为了探究经皮冠状动脉介入治疗支架置入术前后循环EPCs与冠状动脉再狭窄和不良心血管事件的关系，在PCI术前及术后1天取静脉血，通过流式细胞术进行免疫表型分析，总白细胞计数和EPCs鉴定[6]。结果表明，基线EPCs计数与年龄和冠状动脉疾病的程度呈负相关，与另一项研究结果相似[7]。

而在这项研究中，约2/3的患者PCI术后EPCs计数下降，且EPCs计数与PCI术后预后无显著相关性。这与其他研究描述的由于PCI导致内皮损伤进而致使EPCs动员从而使EPCs计数增加有所不同，而对于这些不同的结果，研究者也表明可以通过研究的EPCs亚群的差异以及PCI引起的血管损伤程度的差异来解释[7]。EPCs的研究具有挑战性，目前还没有完全准确定义EPCs的标准，所以导致了EPCs不同亚群的鉴定。同时，内皮祖细胞的动员和功能受到心血管危险因素、伴随疾病和PCI损伤内皮细胞数量的影响，而这些影响又难以控制，因此，需要继续研究，以阐明EPCs在PCI术后再狭窄和预后中的作用。

二、内皮祖细胞与心脏手术

手术后外周血中EPCs的突增可能是多因素的，涉及氧化应激损伤、缺氧和炎性反应，手术后已知的用于募集EPCs的化学引诱物如MIF、CXCL12和CXCL8水平明显增加[8]。当将这些发现转化回体外实验时，结果表明，在体外测量的生理浓度下，既没有CXCL12也没有CXCL8介导的EPCs迁移效应，使用所描述的EPCs分离模型和随后的迁移测定，MIF被鉴定为EPCs迁移的主要介质。在这方面，实验证明MIF和VEGF对缺氧条件下EPCs迁移的影响最大。但是，VEGF的测量显示VEGF在术后的血液浓度中无显著变化，这可能和部分手术中VEGF与肝素的结合有关。因此，MIF可能在心脏手术患者的EPCs募集中在血管生成趋化因子中起主导作用，并且可能通过将EPCs运输到损伤部位来启动并促进心肌缺血再灌注后的愈合过程。MIF水平在心肌缺血再灌注后立即增加，MIF介导的对EPCs募集的影响是否可能影响心脏重塑和血管生成仍然是推测，这对预防心肌缺血再灌注后的心力衰竭具有重要意义[9]。

三、内皮祖细胞与减肥手术

尚不清楚在肥胖症中毛细血管密度或循环内皮祖细胞的数量是否减少，或者是否也存在小血管的纤维化。此外，从未评估过减轻重量对这些参数的可能影响。因此，一项研究调查了25例严重肥胖患者的EPCs和毛细血管密度，均进行了减肥手术，18例血压正常的强壮(able-bodied)患者和12例高血压强壮(able-bodied)患者作为对照。所有患者在减肥手术期间都接受了皮下脂肪活检。在5例患者中，在腹部整形术的外科手术期间，约1年后持续减轻体重后获得第2次活检。肥胖导致EPCs和毛细血管密度降低，体重减轻后EPCs显著增加，肥胖患者的血管胶原含量明显增加。在血压正常的肥胖患者和高血压肥胖患者之间没有观察到血管胶原的显著差异。在显著减轻体重后，胶原蛋白含量几乎正常化。在各组之间及减肥前后的应力应变关系均无差异。综上所述，数据表明肥胖导致微血管稀疏，肥胖患者的EPCs明显减少。减肥手术引起的显著体重减轻似乎能显著改善EPCs的数量，但不能改善毛细血管稀疏，无论血压升高与否，肥胖患者都存在明显的皮下小阻力动脉纤维化，持续的减肥手术可诱导微血管纤维化几近恢复[10]。

四、内皮祖细胞与骨科手术

一项实验在大鼠股骨截骨模型中评估了局部使用体外扩张EPCs对血管生成的刺激和骨折部位骨愈合的促进作用，根据放射学、组织学和显微CT结果，EPCs治疗组与对照组比较，局部EPCs治疗可显著促进大鼠股骨节段性骨缺损的骨再生。在一项类似的研究中，同一研究小组报道局部EPCs治疗对生物力学稳定性有良好的影响[11]。有报道表明，外周血来源的EPCs有助于体外间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的成骨分化，而MSCs支持EPCs的增殖[12]。另外有实验在体外共培养系统中研究了骨髓EPCs (BM-EPCs)与MSCs的相互作用，其数据表明，BM-EPCs和MSCs之间通过旁分泌和直接细胞接触机制发生交联，从而调节血管生成反应[13]。在大鼠模型研究中，观察到EPCs与间充质干细胞之间的协同作用，并认为EPCs在新生血管形成的初始阶段对完全骨再生至关重要，而EPCs治疗的积极效果也已在韧带组织再生中得到证实[14]。另有研究探讨了局部移植的人外周血CD34+细胞对内侧副韧带损伤愈合的影响，与对照组比较，通过肉眼观察，组织学和生物力学评估显示CD34+细胞移植组的韧带愈合显著增强，推测循环人CD34+细胞的局部移植可通过新血管形成促进有利环境来增强韧带愈合过程[15]。基于体外和动物模型EPCs研究的良好结果，临床试验开始。作为一项临床试验的试点病例，有研究报道了将自体外周血CD34+细胞移植到胫骨骨折不愈合患者体内的结果，骨折经细胞移植治疗12周后实现临床及影像学愈合，并且未发生严重的短期并发症[16]。EPCs具有向内皮细胞分化、参与新血管构建等独特功能，可塑性强，可为骨和韧带组织工程提供治疗方案。在不久的将来，可能会吸引更多的研究者来探索这些细胞在骨科手术中的潜力。

五、内皮祖细胞与腹腔镜手术

癌症的进展在很大程度上依赖于新生血管的形成，循环内皮祖细胞具有体外形成完整血管结构的能力，在肿瘤血管生成中发挥重要作用，手术损伤可导致动物模型中EPCs的动员，这可能对癌症患者的预后产生负面影响。有实验研究了20例接受开腹手术治疗各种形式的腹部癌症的患者，以及20例年龄和性别都与其相匹配的健康对照组[17]。术前、术后第1天和第2天分别测定外周血单个核细胞中循环EPCs的数量，其定义为CD34+/KDR+细胞。与基线值比较，手术导致循环EPCs水平在第1天和第2天显著升高，对照组中EPCs水平无变化。手术组的变化幅度明显大于对照组。接受非肿瘤性疾病腹腔镜手术的受试者术后EPCs水平也有所增加。患者手术组和健康对照组的主要特征为：在年龄、性别分布、体重、血脂和血压等方面比较，差异无统计学意义，而手术干预后癌症患者的白细胞计数、血浆C反应蛋白水平明显升高，总、高密度脂蛋白胆固醇、血清甘油三酯下降，EPCs计数的变化与年龄、体重、血脂参数、血压或术后C反应蛋白水平比较差异无统计学意义，手术干预时间是唯一与EPCs计数变化有显著直接关系的因素。本研究证明了腹腔镜手术干预后，循环的CR34+/KDW细胞在腹部肿瘤患者中迅速增加。综上所述，接受选择性腹腔镜手术的癌症患者术后EPCs增加，而手术应激诱导的EPCs动员对肿瘤和肿瘤转移生长的潜在不良影响需要在未来的研究中加以解决。

六、展 望

介入手术后，EPCs被动员通过血液循环向受损伤部位和缺血组织聚集从而发挥其生理作用，参与胚胎血管形成、出生后血管形成、血管创伤后血管愈合、缺血性疾病血管再生等。EPCs的数量反映了修复内皮和血管损伤的内源性能力。另外，EPCs的数量还与高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟、年龄等危险因素呈负相关，与心血管疾病发生率和病死率有关[18～21]。然而，EPCs的研究还未完全，有必要进一步研究EPCs的不同亚型，并评估其在人类疾病中的功能作用，使其在各类手术中的进一步研究成为可能，为外科医生提供新的治疗方式。