针刺单穴和腧穴配伍对胃溃疡大鼠的干预效应及其机制

哈丽娟, 王富春, 刘晓娜

（1.长春中医药大学针灸推拿学院实验针灸教研室，吉林 长春 130117；2.长春中医药大学针灸推拿研究所，吉林 长春 130117；3.长春中医药大学针灸推拿学院针灸临床教研室，吉林 长春 130117）

胃溃疡是常见的胃和十二指肠溃疡性疾病，表现为恶心、烧灼感、嗳气、呕吐、呕血、胃酸和便血等， 以反复发作的节律性胃脘部痛为典型症状［1］。本 病 属 中 医 “反 酸” 和 “嗳 气” 范 畴，西 医认为胃溃疡是黏膜消化性疾病，因多种因素对胃黏膜造成损伤而引起胃蛋白酶和胃酸升高导致，全世界范围内患病率为10%［2-3］。 胃溃疡给患者的身体、心理健康、生活和工作带来严重影响，患者在患病早期，因对本病了解不足或不够重视，导致病情加重，甚至造成糜烂性溃疡和胃穿孔等严重后果，患病后需及时治疗［4-5］。对于胃溃疡的治疗，目前西医的方法比较单一，且不良反应较多。多项研究［6-10］表明：针灸可有效治疗胃溃疡，并缓解疼痛和吞酸等症状。腧穴的选择是针灸取得良好疗效的重要影响因素［11］，历代医家［12-14］对腧穴配伍可提高针灸治疗胃溃疡的临床疗效早有共识，提出了许多配伍方法，现代腧穴配伍研究［15］也取得了一定成果，然而腧穴配伍疗效是否优于单穴尚无充分的科学依据，影响腧穴配伍效应的关键因素也尚未阐明。本实验以正常SD 大鼠和应激性胃溃疡模型大鼠为研究对象，采用束缚-水浸应激法造模，综合运用形态学法和免疫组织化学法检测电针单穴及腧穴配伍后胃溃疡模型大鼠胃黏膜损伤指数和胃组织中上皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR） 蛋白表达情况， 探讨单穴及腧穴配伍对胃溃疡大鼠的干预效应差异及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器100 只健康雄性SD 大鼠由长春中医药大学动物实验中心提供，SPF 级，体质量180～220 g，饲养于清洁动物室，相对湿度为60%～70%， 温度（22±2） ℃， 人工照明，自由饮水。氯化钠、氨基甲酸乙酯、多聚甲醛、石蜡、二甲苯、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）、梯度乙醇、无水乙醇和苏木精染料溶液（吉林省长春市赛因生物科技有限公司），DAB 显色试剂盒、山羊血清和兔抗大鼠多克隆抗体（美国Sigma 公司），生物素标记山羊抗兔IgG 和辣根酶标记链霉卵白素工作液（德国Serva公司）。 820 型薄片切片机（美国AO 公司），UPW-25N 超纯水器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），荧光显微镜（日本Olympus 公司），光学显微镜（日本Nikon 公司）， 全套实验动物手术器械（河南省南阳市卧龙汉医艾绒厂）。

1.2实验动物分组和处理方式100 只健康雄性SD 大鼠随机分为空白组、模型组、中脘组、足三里组和合募配伍组，每组20 只。空白组：不造模，不治疗，正常饲养；模型组：造模后不进行电针治疗；中脘组：模型成功后， 电针中脘穴， 连续10 d；足三里组：模型成功后，电针足三里穴，连续10 d；合募配伍组：模型成功后，电针合募配伍（足三里+中脘穴），连续10 d。

1.3模型制备采用国际上公认的应激性胃溃疡造模方法-束缚-浸水应激法造模［16-17］，造模24 h 之前，大鼠禁食不禁水，放置于长为20.0 cm、直径为6.5 cm 的管状金属网中，悬浮于（18±2）℃的水中，水位达到大鼠的剑突处，时间为12 h，制备应激性胃溃疡大鼠模型。

1.4各组大鼠胃黏膜损伤指数检测10 d 后处死各组大鼠，取出胃组织，沿胃大湾剪开胃壁，将胃体翻转，使胃内面暴露于外，采用0.9% NaCl 溶液和PBS 清洗去除污血，平置于冰块上，在10 倍放大镜下观察胃黏膜组织形态表现。 参考ELIA 等［18］制定的胃黏膜损伤指数分析方法，斑点糜烂计1 分，糜烂长度＜1 mm 计2 分，1 mm≤糜烂长度＜2 mm 计3 分，2 mm≤糜烂长度≤4 mm计4 分，糜烂长度＞4 mm 计5 分；胃黏膜糜烂的计分值之和为胃黏膜损伤指数。

1.5 HE染色观察各组大鼠胃组织病理形态表现取一小块大鼠胃组织（5 mm×10 mm×10 mm），多聚甲醛固定脱水，4 ℃过夜，常规脱水，石蜡包埋，切片，厚度为4 μm，采用45 ℃培养箱干燥，二甲苯脱蜡，水化，蒸馏水洗涤，苏木精染色，脱水，二甲苯透明，复玻片封口，普通光镜下观察各组大鼠胃组织病理形态表现。

1.6免疫组织化学法检测各组大鼠胃黏膜组织中EGFR蛋白表达水平①取一小块胃黏膜组织（5 mm×10 mm×10 mm），采用4% 多聚甲醛固定后，埋入石蜡进行切片，采用防脱片载玻片贴片，在60 ℃下采用烤箱烤切片30 min，采用二甲苯Ⅰ和Ⅱ脱蜡； ②分别在不同梯度（100%、 95%、90% 和80%） 酒精中进行水化，各3 min，在蒸馏水中洗涤3 次，每次各2 min ； ③将 组 织 切 片 放入10 mmol·L－1（pH 6.0） 柠檬酸盐缓冲液中高温高压修复3 min，自然冷却30 min 后，PBS 浸洗3 次；④于组织切片上加入封闭血清，排除非特异性染色造成的干扰并孵育；⑤组织切片加入一抗溶液，于4 ℃条件下孵育过夜；⑥第二天于37 ℃条件下复温60 min，PBS 溶液洗涤，切片组织加滴二抗山羊抗兔IgG 溶液，孵育60 min；⑦PBS 溶液，切片滴入过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30 min；⑧采用PBS 溶液冲洗，DAB 显色液滴于每张切片组织上，镜下随时观察，以确定显色程度，之后蒸馏水反复清洗；⑨采用苏木精复染，蒸馏水反复冲洗； ⑩梯度酒精分化， 每个浓度2 次，每次各2 min；二甲苯Ⅰ和Ⅱ透明，取出切片，擦干周围二甲苯，中性树胶滴在组织旁，再用清洁盖玻片盖上，先放平一侧，再放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。结果判定：阳性结果为细胞膜上或细胞质中有黄色或棕黄色的EGFR 蛋白质染色。每个样本拍摄3 个不同位置，采用Image-Pro Plus 5.0 图像分析系统测定EGFR 蛋白质染色积分吸光度 （integral absorbance，IA） 值，以IA 值代表各组大鼠胃黏膜组织中EGFR 蛋白表达水平。

1.7统计学分析采用SPSS 11.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠胃黏膜损伤指数和胃黏膜组织中EGFR 蛋白表达水平以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠胃黏膜溃疡情况肉眼观察各组大鼠胃黏膜溃疡情况可见：空白组大鼠胃黏膜颜色粉红，无病灶和出血点；模型组大鼠胃黏膜颜色鲜红，有明显溃疡灶及大面积的出血点；中脘组、足三里组和合募配伍组大鼠胃黏膜溃疡程度均有不同程度的减轻，合募配伍组大鼠胃黏膜溃疡程度减轻最明显。见图1 （插页二）。

2.2各组大鼠胃黏膜损伤指数空白组、模型组、中脘组、足三里组和合募配伍组大鼠胃黏膜损伤指数分别为（1.06±0.29）、（42.33±3.57）、（25.85±6.22）、（23.63±5.32） 和（17.22±2.13） 分，模型组大鼠胃黏膜损伤指数最高，与空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05），表明束缚-浸水应激法成功建立了应激胃溃疡大鼠模型；与模型组比较，中脘组、足三里组和合募配伍组大鼠胃黏膜损伤指数均明显降低（P＜0.05）；合募配伍组大鼠胃黏膜损伤指数大于中脘组和足三里组，中脘组和足三里组大鼠胃黏膜损伤指数比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3各组大鼠胃组织病理形态表现空白组大鼠胃组织和窦壁结构完整，固有腺体排列整齐，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠胃黏膜被破坏，腺体数量减少，形状和大小不一，排列紊乱，炎性细胞浸润存在于细胞间隙；中脘组和足三里组大鼠黏膜细胞排列紊乱，可见部分细胞水肿及炎性细胞浸润，组织学改变轻于模型组；合募配伍组大鼠大部分胃黏膜结构正常，上皮较完整，细胞水肿轻度，伴有少数炎症细胞。中脘组、足三里组和合募配伍组大鼠胃黏膜均有不同程度的修复与愈合，效果以合募配伍组最佳。见图2 （插页二）。

2.4各组大鼠胃黏膜组织中EGFR蛋白表达水平空白组、模型组、中脘组、足三里组和合募配伍组大鼠胃黏膜组织中EGFR 蛋白表达水平分别为0.68±0.12、 1.22±0.45、 2.52±0.36、 2.96±0.33 和4.33±0.31。 模 型 组 大 鼠 胃 黏 膜 组 织 中EGFR 蛋白表达水平高于空白组（P＜0.05）；与模型组比较，中脘组、足三里组和合募配穴组大鼠胃黏膜组织中EGFR 蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与中脘组比较，足三里组大鼠胃黏膜组织中EGFR蛋白表达水平升高（P＜0.05），合募配伍组大鼠胃黏膜组织中EGFR 蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与足三里组比较，合募配伍组大鼠胃黏膜组织中EGFR 蛋白表达水平升高（P＜0.05）。

3 讨 论

2002 年，世界卫生组织在《针灸临床研究报告的回顾与分析》 中，详细分析了针灸治疗病症的范围及疗效，肯定了消化性胃溃疡是针灸治疗适宜病症，大量国内外临床及基础研究也证明了针灸对消化性胃溃疡的有效性， 总有效率为75.0%～96.7%［19］。

合募配伍是本课题组经过多年临床总结出的一种取穴简便、配伍精炼和行之有效的腧穴配伍方法，本课题组在国内首次提出 “合募配穴治疗六腑病” 的理论，并对合募配穴进行了较为深入的理论研究和配伍特点分析［20］。中脘穴是治疗脾胃疾病的常用穴，属任脉，为任脉、手太阳与少阳、足阳明之会，是八会穴之腑会，是六腑之气汇聚之处，具有和胃健脾、降逆利水、化湿导滞、理气化痰、安神定志之功，《循经考穴编》 记载：“一切脾胃之疾，无所不疗”；孙思邈《备急千金要方》 云：“中脘主腹胀不通……忧思损伤，气积聚，腹中甚痛……中脘主大便难”；《针灸资生经》 记载：“凡饮食不思，心腹膨胀，面色萎黄，世谓之脾肾病者，宜灸中脘”，徐灵胎曰：“募音暮，气所结聚处”；张介宾曰：“募为脏气结聚之所”，有学者［21］进行了针刺中脘穴治疗消化性溃疡的多中心随机对照试验研究，针刺中脘组患者的综合疗效优于口服泰胃美组，且针刺中脘穴可快速改善胃脘疼痛及食少的症状，足三里是足阳明胃经的合穴和胃腑下合穴，具有调理脾胃、补中益气、通经活络、疏风化湿和扶正祛邪之功能；《针灸大成》 记载：足三里 “主胃中寒，心腹胀满，肠鸣，脏气疲惫，真气不足，腹痛食不下，大便不通……”；《针灸甲乙经》 记载：“五脏六腑之胀，皆取三里……水肿胀，皮肿，三里主之”。该穴主治腑病偏于通降［22］，腑 “以通为用，以降为顺”。

中脘和足三里配伍属合募配伍，合募配伍是指将六腑的下合穴与本经的募穴配伍，因两穴特点皆为治疗腑病，所以合募配伍是取两者在主治上的共性，相互协调，增强疗效，是以治疗六腑病证为主的一种配伍方法，下合穴在主治上偏于内腑，重在通降；募穴在主治上亦偏重内腑或阳经的病邪。因此将合募相配，更适于治疗腑病、实证、热证。下合穴位于下肢，其位在下，与脏腑有纵向联系；募穴位于胸腹部，其位在上，与脏腑有横向联系，二者相配属上下近远配穴。一升一降，升降相合，纵横协调，气机通畅，阴阳相续而腑病可除。有学者［23］观察针刺治疗幽门螺旋杆菌疗效，对38 例患者进行合募配伍（中脘+足三里） 法针刺治疗，取得了满意的疗效。

束缚-浸水应激动物模型是在众多非损伤应激性溃疡动物模型制作方法中应用最广泛的造膜方法，是国际上公认的应激性胃溃疡造模方法。应激性胃溃疡是指在严重创伤，各种手术、烧烫伤、感染和败血症等应激状态下发生的急性胃黏膜病变，特征为浅表性、糜烂炎性溃疡及出血［24］。该模型的制备需要从身体、心理、神经、情绪和精神等方面产生强烈刺激，与临床上患者的发病原因十分相似［25］。情绪变化对胃黏膜与消化系统的影响度极高，可激发胃溃疡症状的发生或加重，当机体、躯体或心理处于应激状态时，激活下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA 轴），增加胃动素的分泌［26］，而胃动素的分泌也促进了酸性胃液的分泌，即引起消化道黏膜糜烂和溃疡。本实验模型大鼠从肉眼形态可看到胃黏膜颜色鲜红，有明显溃疡灶及大面积的出血点，观察HE 染色后的组织病理学，可见大鼠胃黏膜结构被破坏，数量变异，腺体形状变异且排序紊乱，炎性细胞浸润存在于细胞间隙，由此确定本实验的束缚-浸水应激法制作应激性胃溃疡大鼠模型制备成功。

EGFR 是上皮生长因子（epidermal growth factor， EGF） 的受体， 是表皮生长因子（ErbB）家族的一种， 其作用是控制细胞增殖和信号转导［27-28］。EGFR 对 细 胞 外 配 体 结 合 区 域 的EGF 及转 化 生 长 因 子α （transforming growth factor- α，TGF-α） 的亲和性较高，与EGF 和TGF-α 结合后，EGFR 被激活，激活的受体复合体刺激细胞膜内的ras 蛋白， 激活一系列丝裂原激活蛋白（mitogen activating protein， MAP） 激 酶 级 联 反 应， 激 活P13K、MAPK 和Src 及其他信号转导通路，这些信号通路控制细胞的增生、分化和生存［29］。大量研 究［30-31］表 明：EGFR 的 表 达 与 胃 黏 膜 的 修 复 存在关联，即EGFR 与可自发磷酸化的配体结合起来，促进多条下游信号通路的激活及通路上相关蛋白的分泌，可修复受损胃黏膜，治疗胃溃疡。

本研究结果表明：电针可促进EGFR 的表达，并推测可能基于此促进了胃黏膜细胞增生、分化和生存，且合募配伍治疗效果最佳，为电针合募配伍促进胃黏膜修复以及胃溃疡的治疗提供了生物学依据。