苦瓜提取物指纹图谱的研究

韩在祺，张宏梅，李明星，崔佰吉,郝乘仪

(吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

苦瓜，别名凉瓜、癞瓜等，系葫芦科苦瓜属植物的果实。夏、秋季近成熟时采收，具有清热解暑、明目解毒等功效，苦瓜药食同源的特性和显著的生理活性使其成为近年来人们研究的热点[1- 3]。中药指纹图谱技术是目前控制中药、天然药等质量最有效的方法和手段之一,符合中药特色。此项技术不仅可以应用于中药材的真伪鉴别及质量评价、中药制剂生产工艺全过程的质量控制和最终产品的质量评价，还可应用于药效物质成分鉴定和中药药效活性的测定[5],是保证中成药功效、实现中药现代化进展的关键之一[6]。本研究采用高效液相色谱- DAD检测法[7]，建立苦瓜提取物的指纹图谱，为苦瓜的质量评价提供理论依据，为其药效物质基础研究提供可靠方法。

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

LC- 20AT系列高效液相色谱仪(日本岛津)；CAP225D电子天平(Sartorius)；SHZ- D3循环水真空泵(予华仪器有限公司)；GSY- 2不锈钢电热恒温水浴锅(北京市医药设备厂)；KQ- 250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；202- 2AB型电热恒温干燥箱(泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试 剂

甲醇(批号：20100826)天津市永大化学试剂有限公司；磷酸(批号：20120722)天津市光复精细化工研究所；乙腈(批号20111126048)山东禹城实业有限公司化工分公司；苦瓜市售；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WondaSil C18 色谱柱(5 μm,250 mm×4.6 mm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液梯度洗脱(0→5→15→35→50→60 min，20%→20%→45%→80%→45%→20%甲醇)；流速：0.8 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 供试品溶液的制备

苦瓜去籽切块后，置于75 ℃恒温干燥箱中完全烘干。精密称取称取干燥苦瓜10 g，置500 mL圆底烧瓶中，加入100 mL的80%乙醇，水浴加热回流1.5 h，提取两次，合并提取液，定容至200 mL容量瓶中，用0.45 μm的微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 方法学研究

方法学验证过程中，采用选取参照指纹峰的保留时间和色谱峰面积为基准，其他指纹峰采取相对保留时间和相对峰面积的比较方法，分析指纹峰过程中，47号色谱峰峰型良好，分离度和理论塔板数均符合要求，所以选择47号峰作为参照指纹峰。

2.3.1精密度实验

取同一份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下连续进样6次，计算各6次进样下各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积。结果显示，主要色谱峰的相对保留时间的RSD值范围0.17%～0.85%，相对峰面积的RSD值范围为0.66%～1.01%，表明各主要色谱峰具有较好的一致性，系统的精密度良好。

2.3.2重复性实验

取同一批次苦瓜提取物供试品6份，按“2.1”项色谱条件下分别进样测定，以最高峰的物质为参照峰，计算各主要色谱峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值。结果显示，主要色谱峰的相对保留时间时间及相对峰面积的RSD值范围为0.08%～0.88%，相对峰面积的RSD值范围为0.85%～1.65%。结果表明，系统具有良好的重复性。

2.3.3料液比对荷叶多酚提取率的影响

取同一份供试品溶液,按“2.1”项色谱条件下以一定的时间间隔0、2、4、6、12、24 h依次进样分析，以最高峰的物质为内参照物，测得各主要色谱峰的相对保留时间、相对峰面。结果显示，主要色谱峰的相对保留时间时间及相对峰面积的RSD值范围为0.14%～0.58%，相对峰面积的RSD值0.33%～1.55%，表明同一色谱条件下供试品溶液中主要物质在24 h内稳定。

2.4 共有峰的标定

按“2.2”项下方法制备苦瓜提取物供试品10批，按“2.1”项色谱条件下进样，记录色谱图。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012)”进行图谱处理，生成对照色谱图,并进行数据匹配得HPLC- DAD色谱图中共有峰32个，以峰面积占总峰面积大于0.1%为依据，选定为强峰共找出15强峰，计算各强峰的相对保留时间的RSD值范围为0.08%～0.98%。

2.5 指纹图谱评价

按“2.1”项下色谱条件，对10批苦瓜提取物供试品进行分析。以10批指纹图谱各峰均值生成对照图谱，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012)”计算各批次样品的HPLC- DAD指纹图谱相似度。由实验结果可知，各批次之间的苦瓜相似度差异比较大，相似度范围为0.599～0.902，提示苦瓜虽然外观颜色和外形的判断不能体现出苦瓜的有效营养成分的差异，通过指纹图谱的研究可以看出，各个不同产地的苦瓜其内在质量存在很大的差异。

3 讨 论

指纹图谱在应用的过程中，往往需要确定研究过程中的具有代表性的成分作为指纹图谱相对保留时间和相对保留峰面积的计算标准。本研究过程中进行了多种成分的检查和对比，没有取得合适的标准物质作为指纹图谱建立过程中的标准物质，最终选择了图谱中具有代表性的47号峰，作为本研究的指纹图谱的基准物质，从而对指纹图谱的相关数据进行适当的处理，使得苦瓜指纹图谱的研究更加合理化。本课题组还在继续进行苦瓜有效成分的分离工作，在指纹图谱技术的指导下，完成各有效成分的分离、纯化工作，进一步完成苦瓜有效成分的保健功能的研究，进而为苦瓜指纹图谱技术提供更有力的技术保障，为苦瓜资源的合理利用提供理论依据。