肠道类器官的构建及应用*

孙霞，詹丽杏

中国科学院营养代谢与食品安全重点实验室/上海营养与健康研究所/中国科学院上海生命科学研究所 上海 200031

类器官（organoids）是一种衍生于干细胞并具备三维结构的培养模型[1]。体外培养的类器官含有特定组织或器官的各种成熟细胞，因此可以部分模拟其生理功能[2]。自2009年荷兰科学家Hans Clevers等[3]第一次用成体干细胞（即小肠干细胞）培育出具备小肠绒毛和隐窝结构的肠道类器官以来，组织类器官培养技术飞速发展，在2013年和2017年分别被《Science》和《Nature Methods》杂志评为年度十大进展和突破。目前，研究人员已成功培养出多种类器官，比如结肠[4-5]、肝[6]、胰腺[7]、前列腺[8-9]、胃[10]、 乳腺[11]等。这些类器官不但保持原器官稳定的表型和遗传学特征，而且可以在体外长期培养，并可以冷冻保存[2]。除了来源于健康组织的类器官，多种来源于肿瘤的类器官也构建成功。与传统2D细胞培养模式相比，3D培养的类器官结构能更好地模拟组织器官的生成及病理过程，因而在基础研究以及转化医学方面具有广阔的应用前景。

肠道类器官作为发展比较早的类器官模型之一，近几年研究进展迅速。目前，肠道类器官的培养主要来源于两种干细胞类型，分别是富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5阳性（leucine-rich re⁃peat-containing G-protein coupled receptor 5，LGR5+）成体干细胞和多能干细胞（pluripotent stem cell，PSC）[12]。类器官模型建立以来，特别是人源肠道类器官建立以来[4]，被广泛用于炎症性肠病、肠道损伤再生、肠癌等多种肠道疾病的研究。现就肠道类器官的构建以及其应用做一述评。

1 肠道类器官的体外构建及培养

1.1 肠道干细胞

肠道上皮由隐窝—绒毛这个基本单位构成[13]，肠道干细胞就位于隐窝的底部，它们快速分裂增殖产生过渡扩增（transit amplifying，TA）细胞[14]。TA细胞沿着隐窝向上迁移并生长至绒毛两侧，同时伴随着增殖分化，最终形成成熟且完全分化的肠功能细胞，包括肠上皮吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞、内分泌细胞等[13]。2007年，Hans Clevers等[15]利用体内谱系示踪技术，发现LGR5+仅表达于隐窝底部柱状细胞表面，证实LGR5+细胞是真正的肠道干细胞。LGR5是一种跨膜蛋白，与配体R-spondin1结合可增强Wnt-β-catenin信号通路[16]。在隐窝底部，LGR5+干细胞与潘氏细胞交错排列，CD24+潘氏细胞可以表达表皮生长因子EGF、Wnt激动剂Wnt3A、转化生长因子TGF-α、Notch配体Dll4，这些因子可以促进干细胞的增殖分化[17]。

1.2 肠道类器官的建立

自从肠干细胞特异性标记物Lgr5得到鉴定以后，肠道干细胞的研究得到了迅速发展。2009年Hans Clevers等[3]，首次利用小鼠Lgr5+干细胞在体外培养出3D小肠绒毛状上皮空心球体结构，至此类器官研究时代到来，而肠道类器官的建立为其他类器官的建立提供了基础。他们是将整个隐窝结构或者单个Lgr5+干细胞种植到基质胶中，然后利用无血清培养基进行培养，培养基中有三种必须的生长因子：R-spondin1、EGF、Noggin。其中R-spondin1是Wnt激动剂，同时也是Lgr5的配体，在体内可以导致隐窝的大量增殖[18]；EGF信号主要促进小肠细胞的增殖[19]；Noggin是BMP通路抑制剂，可以增加类器官中隐窝数量[20]。对于结肠类器官，还需要加入Wnt3A来维持干细胞的自我更新及分化能力，因为结肠中没有分泌Wnt3A的潘氏细胞[4]。通过这种方法培养出来的类器官，极化的上皮细胞紧密连接形成中空的管腔样结构，腔内有凋亡脱落下的细胞。随着类器官的生长，干细胞可通过出芽的方式向外突出生长形成更多的隐窝状结构。且类器官中含有各种肠上皮细胞，各细胞比例也和体内一样，潘氏细胞和内分泌细胞也可以向腔内分泌物质，吸收细胞也具备吸收功能[21]。除了用这种基质胶和生长因子培养类器官外，同年，Kuo实验室[22]运用气液交互（air-liquid interface，ALI）培养技术也培养出肠道类器官。

相比较于小鼠肠道类器官的建立，人源类器官的建立相对更加复杂。2011年，Hans Clevers等[4]成功构建出可以长期培养的人源肠道类器官。该团队首先用小鼠类器官基本培养基WENR（Wnt3A、EGF、Noggin、R-spondin）来构建人源结肠类器官，刚开始细胞会存活，但是后来会在一周内逐渐死亡。研究人员通过筛选发现，除了加入基本生长因子外，还需要添加一些激素和维生素类物质，如加入胃泌素（gastrin）和烟酰胺（nicotinamide），可以延长类器官的存活时间；另外加入A83-01（ALK4/5/7抑制剂）和SB202190（p38抑制剂），可以抑制类器官的死亡，提高类器官形成率。在这样的培养条件下，人源结肠类器官呈现出芽状结构，增殖的干细胞处于出芽部位，人源小肠类器官构建成功。肠道类器官经过传代培养，可以存活6个月以上，并且可以保持基因型不变。这种培养基可以用于人类肠道类器官的长期培养与扩增，但却不能像小鼠类器官那样可以分化为各种肠上皮细胞。有趣的是如果在扩增培养基基础上去除Wnt3A、nicotin⁃amide和SB202190，则可以诱导肠干细胞分化为各种终末分化结肠上皮细胞[4]。

1.3 肠道肿瘤类器官的建立

类器官培养不仅可以来源正常组织，还可以来源于肿瘤组织，构建形成肿瘤类器官。同样，将结直肠癌（colorectal cancer，CRC）组织消化后种植于基质胶中，用类器官培养基进行培养。研究发现培养出来的肿瘤类器官没有与之对应的正常类器官长得快，可能的原因是肿瘤类器官有丝分裂失败率较高，导致肿瘤细胞死亡[23-24]。为了构建比较单纯的肿瘤类器官，培养皿中正常类器官需要去除。因此，制定只适合肿瘤类器官培养的选择性培养基非常重要，由于肿瘤组织某些促存活的信号通路被异常激活，因此可能不需要某些生长因子。比如，在大多数CRC中，Wnt信号特异性激活，培养这类肠癌类器官时可以去除Wnt和R-spondin1[4]，而这两种因子对正常组织类器官培养非常重要；同样，对于存在EGFR通路突变的CRC，可以去除EGF[23,25-26]；nutlin-3通过抑制E3泛素连接酶MDM2稳定p53，可以用来培养p53突变的结肠癌类器官[23]；如果存在p38突变，则不需要加入p38抑制剂SB202190来维持生长[4,25,27]；在晚期CRC中，癌细胞对氧浓度比较敏感，在低氧情况下可能更适宜肿瘤类器官的培养[25]。通过不同生长因子的组合及建立不同培养环境，可以构建出各种突变类型的肠癌类器官。通过这种方法培养出来的类器官保留了原肿瘤的组织病理学特征以及基因稳定[27]，可以应用于肿瘤的基础研究以及转化医学。

2 肠道类器官的应用

2.1 肠道干细胞及发育研究

肠道类器官培养技术可以用于研究干细胞的各种特性，包括存活、自我增殖以及体外的长期培养。该技术结合各种基因工程小鼠的谱系示踪实验，可用于鉴定肠道干细胞特异性标志物[2]。Spence等[28]首次利用人多能干细胞（hPSC）体外诱导成为小肠类器官，利用此系统可以模拟小肠发育过程以及研究人类先天性肠组织发育缺陷的分子基础，并且在体外直接证明了转录因子NEUROG3对肠内分泌细胞的发育至关重要。Múnera等[29]鉴定出一条进化上保守的BMP-Hox通路，这条通路调控结肠的发育，在体外短暂激活BMP信号可以促使hPSC发育成为结肠类器官，通过建立不同区域的肠道类器官可以用来研究肠道如何产生区域化干细胞。

2.2 肠道疾病的研究

肠道类器官模型可用于肠道疾病的研究。可以用来源于炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者的干细胞构建IBD类器官模型。此种类器官在体外可以长期培养，并具有稳定遗传学特征和生物特性，可以用来研究肠炎发生的分子机制[30]。囊性纤维化（cysticfibrosis，CF）可由单个基因CFTR突变引起，导致肠黏液过度分泌和粘度增加，从而影响肠道功能[31]。利用CF患者的肠干细胞构建的这些类器官可以保持与患者基因型一致以及肠细胞的异常功能，因此有助于CF诊断、发病机制研究以及药物研发等[32]。肠道类器官为研究肠道菌群及病毒感染提供了有效的模型，例如C.艰难梭状芽孢杆菌、肠道沙门氏菌、轮状病毒和肠出血性大肠杆菌等肠道病原体与人肠道上皮的相互作用已经用此模型得到证明[33]。研究表明将艰难梭状芽孢杆菌微注射到小肠类器官管腔中，发现钠吸收蛋白NHE3表达下调引起艰难梭状芽孢杆菌相关的腹泻[34]。如果将鼠伤寒沙门氏菌微注射到小肠道类器官中，它能够入侵上皮屏障并且改变类器官的转录谱，并以此来探究沙门氏菌引起肠炎的分子机制[35]。

2.3 肠道再生修复

肠道类器官的建立可以在体外利用肠干细胞培养出大量类器官，这为肠道的再生修复提供了条件。早在2012年，Yui等[36]通过在体外培养结肠类器官，并将其移植到DSS诱导的结肠炎小鼠体内，发现类器官可以到达损伤的上皮位置，修复损伤的肠道。这项实验如果能运用到人类身上，可以取患者少量肠道干细胞，通过离体培养扩增源自患者的类器官，最后将其移植到靶向病灶，令肠道上皮再生治愈肠道疾病。科学家们可以使用hPSC来诱导产生肠道类器官，相信更复杂的肠道类器官的建立可能会为患者提供专用的“备用零件”来修复受损的组织。例如，James Wells等[37]利用hPSC在体外将肠道类器官和神经祖细胞结合在一起，成功构建出具有神经系统的肠道类器官。如果将此系统植入小鼠体内，类器官生长6～10周出现血管化，并形成高度成熟的肠道组织，其中包含的神经元和神经胶质细胞会整合到肠道黏膜层控制肠蠕动。这是再生医学的一个主要进步性标志，肠道类器官的出现为其在肠道再生医学领域的研究开辟了一条新道路。

3 肠道肿瘤类器官的应用

3.1 创建肿瘤类器官生物样本库（biobanks）

目前，研究者分析的大部分样本仅代表原发肿瘤，而转移通常提示癌症的致命阶段。而患者来源的肿瘤类器官PDO（patient-derived organoids）可以扩大肿瘤样本，从而能够在任何阶段对癌症进行分析[38]。2015年，Hans Clevers等第一次成功构建了20个不同突变类型CRC患者的肿瘤和与之对应的正常组织类器官库。测序发现PDO保留了原CRC患者的基因组和转录组，利用这些类器官库可以进行大通量的药物筛选，研究人员发现只有Wnt拮抗剂泛素连接酶RNF43突变的肿瘤类器官才会对Wnt分泌抑制剂LGK974敏感[27,39]。较多数量的类器官可以验证特定突变类型CRC与已知药物的相关性，并且可以筛选出起作用的药物。随后，研究人员利用此肠癌类器官库，分析类器官的蛋白质组和转录组，指出蛋白质组对肿瘤治疗非常重要[40]。后来，Sato实验室构建了来源于55位CRC患者的肿瘤类器官库，根据不同CRC基因突变类型，用不同培养基培养，进一步提高了PDO的成功率。并且将培养的PDO移植到免疫缺陷小鼠的肾囊中，还可以保持组织病理学特征，这表明可以利用PDO在更复杂的体内环境中来评估药物的敏感性[25]。目前，各个癌症研究所都致力于建立更完善的类器官库，使之成为有利的公共研究资源，为肿瘤的药物筛选和个性化治疗提供条件，有助于促进精准医学的发展。

3.2 作为肿瘤模型研究结肠癌发生发展机制

传统的二维（2D）肿瘤细胞系培养和动物人源性肿瘤异种移植物（primary patient-derived tumour xenografts，PDTXs）长期以来一直被用做肿瘤模型，并为癌症研究做出了巨大贡献。但是细胞系由于大量传代可能经历了遗传变异，不能保持原始肿瘤的遗传异质性，而PDTXs成功概率比较低。肿瘤类器官模型可以避开了这些缺点，它既保持了原肿瘤在体内的生物学特性和遗传学特征，又便于操作、成功率高，成为一种新兴的肿瘤研究模型[41]。

由于PDO可以从不同发展阶段的肿瘤组织中获得，并且可以保留肿瘤的病理特征和异质性[27]。因此可以用PDO对不同阶段CRC进行转录组化分析及表观分析，发现随着肿瘤发展基因突变率增加，可获得新的突变特征，肿瘤异质性增加[42]。同样的结果在来源于正常小鼠和Apcmin/+小鼠的类器官中也被发现，随着正常细胞向癌细胞的转化，类器官累计突变不断增加，疾病进展加速[43]。在研究组织癌变的过程中，类器官可用于模拟和研究CRC的发生发展过程，如对正常类器官进行基因编辑以获得CRC进展模型。Drost等[44]通过使用CRISPR/Cas9技术，对CRC中四个常见的突变基因APC、p53、KRAS和SMAD4依次进行编辑，发现四种基因都突变的类器官可以不依赖于外源生长因子存活，并且证明APC和p53的缺失是导致CRC的关键。当把具有四种基因突变的类器官皮下移植到小鼠中时，它虽然可以有效生长但不能自发转移，但是将其原位移植到小鼠盲肠时发现，这些类器官诱导发生的CRC能够自发转移，说明肠道类器官微环境对于肿瘤的转移非常重要。类似的，在正常结肠类器官中引入Braf V600E突变可以构建锯齿状结肠癌模型，利用此模型证明TGFβ信号促使锯齿状结肠癌向预后更差的间充质型结肠癌亚型转变[45]。由此肿瘤类器官培养与基因编辑技术相结合，极大地促进了CRC的研究进展。

通过特异性消除LGR5+干细胞的类器官模型可以研究肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）对CRC发展的作用，研究提示杀伤CSCs并不能直接导致原发肿瘤的消退，但是其对CRC肝转移的形成和维持是必须的[46]。同样，Shimokawa等[47]对CRC类器官进行小鼠肾囊移植，然后通过可诱导的caspase9对LGR5+干细胞进行敲除，结果显示虽然肿瘤出现短暂退化，此后由KRT20标记的分化肿瘤细胞可转变为LGR5+CSCs，从而促进肿瘤进展，可见肿瘤细胞具有很强的可塑性。利用类器官也可以作为研究菌群及其代谢物对CRC的作用，Ruben van Boxtel和Hans Clevers研究组对培养的肠道类器官内腔进行pks+大肠杆菌注射，发现pks+大肠杆菌产生的毒性物质Co⁃libactin可以引起人肠道类器官中的双链内交联以及DNA双链损伤，进而造成癌变的发生。在结直肠癌患者的DNA中也发现了相似的突变模式，从而将人体内的微生物与驱动癌症发生发展的遗传变异建立了直接联系[48]。利用类器官模型研究肠道微生物与CRC的关系，为结直肠癌发病机制和治疗提供了重要工具。

3.3 肿瘤药物筛选和个性化治疗

尽管2D培养的肠癌细胞系一直用于检测药物反应，但细胞系无法完全代表CRC的各种亚型，因此2D实验结果不能全面体现在体疗效[49]。而PDO能够很好地保留患者肠癌的基因组特征，由此可以进行大规模的药物筛查，为不同患者制定个体化治疗提供帮助。肿瘤类器官库的建立为患者药物筛选和精准治疗提供了条件和可能性。Hans Clevers等[50]利用囊性纤维化（CF）患者的类器官来检测其对各种药物的反应。他们测试了源自荷兰600名囊性纤维化患者的类器官，通过观察药物是否能够引起类器官膨胀来决定该药物是否对患者起作用。在肿瘤治疗中，与化疗药物的普遍性杀伤不同，免疫疗法具有较高的特异性。E.Voest实验室[51]利用外周血单核细胞与肺癌或结直肠癌肿瘤类器官共培养诱导出一群肿瘤特异性T细胞。进一步研究发现这群肿瘤杀伤性T细胞不会攻击正常组织类器官，或可在回输进患者体内后起到抗肿瘤效果。此类研究提示了利用肿瘤类器官进行免疫疗法的可能性。

4 类器官局限与展望

以上总结了类器官的建立以及在肠道疾病和肿瘤中的作用，但许多研究都处于起始阶段，仍然有很多困难需要克服。比如相对于细胞系来说，类器官的培养耗费较大的时间和费用。此外，类器官的培养缺少血管和免疫细胞，预期今后可将类器官与包括免疫细胞共培养等来解决此类问题。另外，当类器官体积增加时缺氧和缺乏生长因子会导致类器官坏死，因此需要适当激活血管生成途径以此促进类器官的存活。另一个需要解决的问题是目前类器官的培养基是小鼠来源的基质胶，这对人源的类器官的培养可能并不是最合适的。目前，一种新合成的“水凝珠”能够支持小鼠和人源类器官的生长，它可能会用于代替小鼠来源的基质胶[52]。最后，目前所构建的类器官都来源于上皮细胞，非上皮细胞类器官的建立还没有构建成功。虽然类器官有一些局限性，但是它的应用前景非常广泛，类器官的发展是未来转化医学不可或缺的基石。