中性粒细胞胞外陷阱在溃疡性结肠炎中的研究进展

罗 婷， 潘秀军

（上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092）

一般认为中性粒细胞通过趋化、吞噬、脱颗粒等一系列作用抵御病原微生物入侵，随着研究的深入，发现中性粒细胞还存在另一种特殊形式的免疫应答，即通过产生中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）参与机体的免疫防御[1]。最初对NET的研究主要集中在感染性疾病，后续的研究发现，NET与自身免疫性疾病的发生、发展也密切相关。溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种常见的自身免疫性疾病，中性粒细胞在UC的发病机制中发挥着重要作用[2]，但NET作为中性粒细胞发挥免疫功能的一种特殊结构，在UC发病中的作用机制尚不明确，近年来逐渐引相关研究人员的关注。我们对NET在UC发病中的研究进展作一综述，以期对UC的诊断及治疗提供进一步的理论支持。

1 UC

UC是一种以肠道慢性炎症性病变为主要特征的自身免疫性疾病，典型的UC患者表现为便血、腹痛及腹泻，目前内镜检查是诊断UC的金标准[3]。UC的发病率在全球呈逐年上升趋势，其病因涉及遗传、环境和免疫等多种因素[4]，但具体的发病机制尚不完全明确。已有研究结果表明，中性粒细胞在UC结肠黏膜中大量浸润，随着活性氧的产生和丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶和髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）等一系列物质的释放，细胞进入隐窝腔内形成特征性的隐窝脓肿[5]。临床上将中性粒细胞浸润作为UC的组织病理学标志，反映UC的黏膜破坏情况，肠黏膜组织学检查发现中性粒细胞减少或消失可提示UC治疗有效，因此可根据中性粒细胞黏膜浸润的变化情况进行疗效评估。然而，中性粒细胞在UC肠道黏膜中的确切作用机制仍不明确，NET作为中性粒细胞发挥作用的一种新形式，引起了研究者的关注[6-8]。

2 NET及其形成

1996年，TAKEI等[9]的研究发现，中性粒细胞存在一种特殊的死亡形式，这种形式有别于传统的凋亡和坏死，在此过程中，中性粒细胞会经历一系列的形态变化，释放出DNA和胞内颗粒蛋白等物质并最终死亡，但产生这一现象的具体机制尚不明确。2004年，BRINKMANN等[1]详细报道了这一过程，并首次将释放出的特殊结构命名为NET，这是一种具有杀菌效应的含有DNA和颗粒蛋白的网状结构。随后的研究发现，中性粒细胞能被佛波酯（phorbol myristate acetate，PMA）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）等多种因素激活，启动NET，即染色质解聚，分叶核特性逐渐消失，嗜天青颗粒中的弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）被释放并移位至胞核，作用于组蛋白使其降解，随后颗粒膜和核膜逐渐崩解，颗粒中的MPO等其他多种蛋白质进入核内，与解聚的染色质混合，最终细胞膜破裂，混合了组蛋白、NE和MPO等多种胞内蛋白质的DNA网状纤维结构被释放至胞外空间[10]。为了区别于细胞凋亡及坏死，这一过程被命名为NET[11]。目前的报道认为NET存在3种形式[12]：（1）自杀式NET[13]，这一过程是经还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）及PKC-Raf-MERK-ERK通路实现的，一般需要2～4 h；（2）存活式NET[14]，此类NET释放不伴有细胞膜的破裂，由相关刺激识别Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）和补体3（complement 3，C3）的补体受体诱导中性粒细胞活化形成NET，以囊泡形式经细胞膜释放，而活化的中性粒细胞最终成为细胞膜完整的无核胞质体，这种无核胞质体仍然能够吞噬病原体，被称为存活式NET，通常需要5～60 min；（3）源于线粒体DNA的存活式NET，通过这种方式产生的NET，其结构中的DNA来源于中性粒细胞线粒体，而前二者组分中的DNA均来自于细胞核，一般仅需15 min左右。

3 NET与UC

传统理论认为，中性粒细胞是通过趋化、吞噬和脱颗粒等一系列作用抵御病原微生物的入侵，而NET作为中性粒细胞固有免疫应答的一种特殊形式，通过限制病原微生物活动杀灭病原微生物，在抗微生物感染中发挥了积极作用。早期对NET的研究主要集中在感染性疾病，随着研究的深入，越来越多的学者发现，NET也参与了其他一些非感染性疾病，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）、类风湿性关节炎、UC等多种自身免疫性炎症性疾病的发病过程[12]。然而有别于在感染性疾病中积极的抗感染作用，NET在非感染性疾病中可能发挥了消极作用，反而促进了炎症的发生和发展。因此，正确认识NET在非感染性疾病中的作用对于阐明疾病的发生机制及对治疗靶点的寻求具有重要意义。近年来，NET在UC发病中的研究也逐渐引起了相关人员的关注，并已取得了一些初步结果。

3.1 UC结肠黏膜中存在与NET相关的炎症反应

2011年，SAVCHENKO等[15]发现在UC患者结肠炎性黏膜中存在NET，并在NET的形成过程中伴随着炎性蛋白正五聚蛋白（pentraxin，PTX）3的释放。PTX3是PTX家族的成员之一，属进化中高度保守的模式识别蛋白家族[16]。根据分子结构和长度的不同，PTX被分为2个组：一组是短PTX，主要包括C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和血清淀粉样物质P组分（serum amyloid P-component，SAP），由肝脏产生；另一组为长PTX，PTX3是最早被报道的长PTX，被认为是一种急性期蛋白，在健康人群中含量很低，当受到白细胞介素-8（interleukin 8，IL-8）、TNF-α等炎症因子刺激时，中性粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞释放PTX3增加[17]。在UC患者中，PTX3主要来源于中性粒细胞，并且伴随NET的形成而释放，反映了肠黏膜炎症的存在[15]。该研究还进一步分析了NET、PTX3与UC炎症程度的相关性，采用免疫组织化学技术，按照Matts'分类标准将UC患者炎症等级分为5级[18]，比较了不同等级患者结肠黏膜PTX3和NET的表达情况，结果发现，随着炎症程度的增加，PTX3表达增强，同时伴随NET形成增加，NET的形成、PTX3的释放与UC的炎症程度呈正相关。另外，NET形成还伴随着促炎因子如S100蛋白质类及天青杀素的释放，进一步加重了组织的炎症反应[15]。

随后，有学者在不同的人群中采用不同的研究方法，均证实了UC中NET的存在。2015年BENNIKE等[19]针对UC成年患者开展了一项蛋白质组学研究，采用液相色谱-质谱联用仪对10例成年UC患者和10名健康对照者的结肠黏膜组织进行蛋白质分析，结果发现有46种蛋白质在2个组研究对象中存在表达差异，其中11种蛋白质与中性粒细胞和NET相关，包括乳铁蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶、MPO、S100-A9蛋白、S100-A12蛋白和组织蛋白酶G等。同时，通过DNA染色的方式观察到了UC患者肠道黏膜组织中的NET。值得一提的是，该项研究收集的UC患者肠道黏膜组织样本均来自于肉眼所见形态学正常的肠黏膜，表明在UC患者中表观正常的肠黏膜组织也已存在与NET相关的炎症反应，推测NET可能在发病的早期即存在，且参与了早期炎症反应。GOTTLIEB等[20]对6例儿童UC患者和2名儿童健康对照者的结肠黏膜组织进行免疫荧光分析，对NET主要组分的DNA、组蛋白、弹性蛋白酶和MPO作多重荧光染色后进行图像采集，在所有患者结肠黏膜组织中均观察到NET，而健康对照者均未表达。DINALLO等[21]的最新研究分别采用蛋白免疫印迹法和免疫荧光技术检测了23例UC患者和12例结肠癌患者的肠黏膜组织，结果发现UC患者肠黏膜组织中的NET相关蛋白NE、MPO和组蛋白H3等的表达均显著高于对照组，也证实了NET在UC患者中表达上调，而高表达的NET又能促进UC患者黏膜固有层单个核细胞产生TNF-α和白细胞介素-1β（interleukin 1 beta ，IL-1β），进一步加剧了炎症状态。

综上所述，成人及儿童UC患者的肠道组织中均证实了NET的存在，推测NET可能参与了疾病早期的炎症反应，并且高表达的NET又能促进炎症因子的释放，加剧炎症反应。

3.2 UC中NET的生成与降解失衡导致其高表达

一般情况下，机体内NET的生成与降解之间维持着动态平衡，如果NET的生成增加或降解减少将导致其高表达，而过量的NET长时间存在于体内会引起组织损伤。

3.2.1 UC患者NET生成增加 在感染性疾病中，NET由多种病原微生物刺激形成[12]，而在自身免疫性疾病等非感染性炎症性疾病中，IL-8、TNF-α、LPS、IL-17A和抗蛋白酶3型中性粒细胞胞质抗体（proteinase 3-antineutrophil cytoplasmic antibody，PR3-ANCA）[21-24]等多种因子可刺激NET形成。

TNF-α是一种促炎介质，在UC患者中高表达，并且与UC患者肠黏膜炎症程度呈正相关[25]。DINALLO等[21]不仅证实了UC患者肠黏膜组织中NET高表达，也证明了UC患者体内的中性粒细胞可在TNF-α的刺激下形成NET，而经抗TNF-α治疗后的UC患者中性粒细胞产生NET的能力明显降低。目前，使用生物制剂英夫利昔单抗治疗UC是一项较为成熟的方案，而英夫利昔的作用成分正是一种针对TNF-α的特异性抗体，根据DINALLO等[21]的研究结果推测，英夫利昔可能不仅能通过拮抗TNF-α达到治疗目的，而且能使TNF-α刺激NET的形成减少，从而阻断了NET促进黏膜固有层单个核细胞进一步产生TNF-α和IL-1β等这一炎症的放大过程，达到明显减轻炎症反应的治疗效果。

IL-8是一种趋化因子，在炎症部位中性粒细胞的活化和聚集中发挥重要作用[23]，有学者推测IL-8可能参与到了NET的形成过程，这一推测由BRINKMANN等[1]最先证实，即中性粒细胞在IL-8刺激过后能够形成NET。随后又有报道显示，胎盘来源的IL-8可在体外刺激中性粒细胞产生NET[26]，而这一过程可被抗IL-8中和抗体所阻断，说明IL-8这一炎症因子在NET形成过程中发挥了积极的作用。在UC中IL-8高表达[27]，从而推测高表达的IL-8促进了UC患者NET的形成，但目前抗IL-8治疗的相关研究仍未取得预期的效果。

一项抗中性粒细胞胞质抗体（antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相关性血管炎的研究表明[24]，由ANCA介导的中性粒细胞激活可诱导NET形成，NET的形成有赖于中性粒细胞的激活，抗蛋白酶3型中性粒细胞胞质抗体（antiproteinase 3 antineutrophil cytoplasmic antibody，抗-PR3 ANCA）或抗髓过氧化物酶型中性粒细胞胞质抗体（anti-myeloperoxidase antineutrophil cytoplasmic antibody，抗-MPO ANCA）自身抗体可通过结合中性粒细胞表面的PR3或MPO抗原激活中性粒细胞，促进NET的形成。有研究证实，一部分UC患者血清中存在着抗-PR3 ANCA，是临床辅助诊断炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的一种血清学标志物[28]，然而抗-PR3 ANCA在UC患者NET的形成中究竟发挥了怎样的作用，也是值得关注的一个研究节点。

3.2.2 UC患者NET降解受损 DNA酶I（dexoyribonuclease I，DNase I）是机体内降解NET的主要酶，这一酶的缺陷将直接导致NET的降解受损[29]。如在SLE中，NET的生成与降解失衡导致了大量NET的堆积，一方面，MPO、抗菌肽LL-37等NET蛋白质组分出现在细胞外空间并持续存在，刺激宿主免疫系统发生免疫应答，进而产生相应的自身抗体，造成组织损伤；另一方面，SLE患者基因突变导致DNase I活性降低，NET降解受损，使得NET组分抗原持续暴露，加剧了免疫应答，诱导机体持续产生自身抗体，进一步加重了疾病的进展。有研究表明，在IBD患者体内DNase I的活性显著低于健康对照组，且与英夫利昔单抗的治疗效果无关，表明IBD患者DNase I活性降低是一种固有缺陷，可能类似于SLE，由于遗传突变成为易感个体，直接影响了IBD的发生与发展[30]。由此可以推测，由于IBD患者体内存在DNase I活性缺陷，导致对NET降解能力下降，NET的大量堆积进一步促进患者结肠黏膜单个核细胞释放多种炎症因子，加剧了组织的炎症反应。此外，患者体内的NET组分与相应的多种自身抗体结合，可能是阻碍DNase I对NET降解的原因之一。因此，寻找NET降解的影响因素，阻断NET堆积引发的严重炎症反应，对UC潜在治疗靶点的探索具有积极作用。

4 结语

综上所述，UC的发病机制可能是遗传易感个体在外界环境作用下发生了异常免疫反应，产生自身抗体并释放炎症因子，而UC患者高表达的IL-8、TNF-α等炎症因子和自身抗体抗-PR3 ANCA可促进中性粒细胞形成NET。一方面过量的NET组分持续暴露诱导机体免疫系统产生更多的自身抗体加重免疫损伤；另一方面，NET又能刺激肠道黏膜固有层的单个核细胞释放更多的炎症因子，加剧机体的炎症状态。此外，UC患者体内DNase I活性降低可能影响了体内NET的正常降解，导致NET进一步堆积，促进病情的发展。

目前，NET在UC中的研究均为小样本，得出的多为表达差异性结果，尚有待更多大样本研究来验证并揭示NET在UC发病中的确切作用机制。在接下来的研究中应一方面考虑阻断使NET形成增加的影响因素，另一方面尝试修复DNase I活性以期恢复体内正常的NET降解过程，通过体外及动物实验加以论证，从而为UC治疗潜在靶点的探索提供理论支持。