25 株草菇菌株的遗传多样性*

马庆芳，张丕奇，陈 鹤，马银鹏，刘佳宁，戴肖东，韩增华，孔祥辉，张介驰**

（1.黑龙江省科学院 微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 150010；2.黑龙江省科学院 高技术研究院，黑龙江 哈尔滨 150010）

草菇（Volvariella volvace），又名苞脚菇、中国蘑菇，属于担子菌亚门（Basidiomycatina） 层菌纲（Hyoenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 光柄菇科（Pluteaceae） 草菇属（Voluariella）[1]。其味道鲜美、营养丰富，是一种深受民众欢迎的食用菌[2]。草菇属高温型菌类，喜温喜湿，腐生于粪草、秸秆等纤维类基质上，是我国栽培食用菌中方法最简单、出菇最快、栽培原料最丰富的菌类[3-4]。黑龙江科学院微生物所从事草菇研究多年，已完成寒地条件整棒玉米芯生料栽培草菇示范推广，驯化栽培草菇V23、V35 两个菌株，生物转化率达30%以上[5]。为提高栽培效益，筛选更多的适宜寒区生产的草菇菌株，本所从广东、福建、江苏、湖北、山东、河北等省共引进25 个菌株，将表观形态与ISSR 分子标记技术相结合，对草菇菌株的遗传多样性进行研究，确认菌株间亲缘关系，为草菇栽培适应性品比试验奠定基础，缩短选种周期。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株来源于广东、福建、江苏、湖北、山东、河北及黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心，共25 株，供试菌株具体情况见表1。

表1 供试菌株Tab.1 Strains of Volvariella volvace used in the study

1.2 供试引物

根据文献，从UBC 公布的ISSR 引物中筛选出20 条供试引物，由上海生工合成，其序号及引物序列见表2。

表2 供试引物Tab.2 Primers used in the study

1.3 草菇菌株表观形态观察

利用cPDA 培养基观察不同菌株的形态[6]。取3 mm×3 mm 供试菌株块接入cPDA 平板培养基中央，每个菌株3 个重复，30℃恒温培养7 d，观察不同菌株的菌丝形态、生长速度、色素颜色等表观生长形态。

1.4 草菇菌株DNA 指纹图谱（ISSR） 分析

1.4.1 菌丝培养与总DNA 提取

利用PD 培养基进行菌丝培养，接种后28℃静止培养5 d，100 目滤网收集菌丝，无菌双蒸水冲洗2 次，挤去水分，加入液氮研至糊状，使用TIANGEN 公司新型植物基因组DNA 提取试剂盒提取草菇菌丝体DNA，于-20℃冰箱中保存备用。

1.4.2 ISSR 扩增

PCR 扩增总体积为20 μL，使用2×Tap PCR MasterMix（含染料） DNA 聚合酶，15 ng～25 ng 模板DNA，无菌双蒸水补足体积，试验以无菌双蒸水代替模板DNA 作阴性对照。ISSR-PCR 反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃复性40 s，72℃延伸70 s，进行30 个循坏；最后72℃延伸7 min。PCR 产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳，Gel Safelight R＆B Mix 染色，凝胶成像扫描记录结果。将琼脂糖凝胶上出现DNA 片段的记为1，不出现的记为0，统计后用NT-SYS 软件体系进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同草菇菌株表观形态比较

2.1.1 不同草菇菌株生长速度比较

不同草菇菌株在cPDA 培养基上的生长速度差异较大，具体生长速度情况见图1。

如图1 所示，根据不同菌株生长速度快慢将其分成7 组，第1 组：草菇1 号，生长速度最快，平均日生长速度7.45 mm·d-1；第2 组：包括草菇2 号、3 号、5 号、8 号、9 号、16 号和21 号7 株菌株，生长速度较快，平均日生长速度在6.75 mm·d-1～7.17 mm·d-1之间，低于草菇1 号，但差异不显著；第3组：包括4 号、6 号、7 号、11 号、13 号、14 号、15 号、17 号、18 号和23 号10 株菌株，平均日生长速度在6.28 mm·d-1～6.52 mm·d-1之间，略低于第2 组，与第1 组1 号菌株相比差异显著；第4 组：包括草菇10 号、24 号和25 号3 株菌株，生长速度中等，平均日生长速度在5.77 mm·d-1～5.87 mm·d-1之间，与1 号菌株相比差异显著；第5 组：20 号菌株，平均日生长速度为5.47 mm·d-1；第6 组：包括19 号和22 号2 株菌株，生长速度较慢，平均生长速度分别为4.62 mm·d-1和4.71 mm·d-1，与前5 组菌株相比差异显著；第7 组：12 号菌株，生长速度最慢，平均日生长速度仅为3.50 mm·d-1，与前6 组菌株相比差异显著。

草菇菌丝生长速度与菌丝培养的生物量有关，生物量的积累对草菇子实体形成和生长有着重要影响[7]。根据图1 结果以生长速度作为初筛指标，选择生长速度较快的前3 组菌株的1 号、2 号、3 号、4号、5 号、6 号、7 号、8 号、9 号、11 号、13 号、14 号、15 号、16 号、17 号、18 号、21 号和23 号进行栽培筛选试验，而后4 组的10 号、12 号、19号、20 号、22 号、24 号和25 号草菇生长速度慢，不宜作为寒区栽培的菌株。

2.1.2 不同草菇菌株形态比较

不同草菇形态结果见图2。

如图2 所示，依据草菇菌丝形态、气生菌丝着生类型、菌丝状态及基质颜色，将25 个草菇菌株划分成4 个组群，第1 组群：气生菌丝粗壮旺盛，气生型，呈无序棉花糖状，培养基质黄色，包括1 号、5 号、16 号、22 号、23 号和24 号6 个菌株；第2组群：气生菌丝粗壮旺盛，气生型，呈无序棉花糖状，培养基质紫色，包括2 号、3 号、7 号、8 号、9 号、10 号、11 号、14 号、17 号、18 号、19 号、20 号、21 号和25 号14 个菌株；第3 组群：气生菌丝细弱而少，匍匐型，附着于培养基表面，培养基表面呈褶皱状，培养基质紫色，包括4 号、6 号、13 号和15 号4 个菌株；第4 组群：12 号菌株，气生菌丝呈粗索状密集放射状排列，匍匐型，附着于培养基表面，培养基质颜色黄色。

2.2 不同草菇菌株DNA 指纹图谱（ISSR） 分析

2.2.1 ISSR 标记鉴别草菇菌株指纹图谱

本试验共选用了20 个ISSR 引物，有13 个引物对供试的25 个草菇试验菌株有很好的扩增效果，扩增条带清晰，重复性好，菌株的ISSR-PCR 电泳图谱结果如图3、图4 所示。

从图3、图4 中可以看出，PCR 产物片段大小在250 bp～3 060 bp 之间，每个引物可扩增的多态性条数不等，为8 条～20 条，平均每个引物扩增出的条带15.30 条，不同草菇菌株扩增出的谱带差异明显。利用13 个ISSR 引物对25 个供试草菇菌株进行PCR 扩增，共得到199 条DNA 带，多态性条带153 条，其中共有带为46 条，多态性比率为76.88%，说明收集到的草菇菌株具有丰富的遗传多样性，彼此间存在着较明显差异。

2.2.2 ISSR 方法鉴别草菇菌株聚类分析

根据ISSR-PCR 扩增结果，用NT-SYS 软件体系进行聚类分析，菌株聚类分析情况见图5。

从图5 可以看出，25 个供试草菇菌株间的遗传相似水平在0.53～1.00 之间，在遗传相似水平为0.53时将12 号菌株（银丝草菇）与其他草菇菌株区分开，确认银丝草菇与其他草菇菌株之间的遗传差异较大。其他草菇菌株间相似系数在0.77～1.00 之间，在相似系数0.90 时可将供试的25 个菌株分为8 个组群，第1 组群包括1 号和5 号2 个菌株；第2 组群包括3 号、7 号、8 号、9 号、10 号、19 号和21 号7 个菌株；第3 组群包括16 号、23 号和24 号3 个菌株；第4 组群包括11 号、14 号、17 号、20 号和25号5 个菌株；第5 组群包括4 号、6 号、13 号、15号和18 号5 个菌株；2 号、12 号和22 号与其他菌株遗传距离均很远，各自单独为一组群。

24 号菌株是23 号V35 栽培的子实体分离纯化所得，检测遗传相似系数为1.00；11 号菌株和25号菌株都是草菇9715，分别引自华中农业大学和山东莘县食用菌研究所，遗传相似系数为1.00，确认为同一菌株。遗传学上认为，当相似系数高达95%以上时可以确定为同一种内不同菌株[8]，3 号和7 号菌株之间，4 号、6 号和15 号菌株之间（6 号与15号同名），11 号、14 号、17 号和25 号菌株之间，8号、19 号和21 号菌株之间，16 号、23 号和24 号菌株之间，相似系数高于95%，而且表观形态也很相似，可确认为同一菌株或是同一种内的不同菌株；而5 号、14 号、22 号3 个菌株引自不同单位，名称都是草菇V97，但表观形态和ISSR 聚类分析差异都很大，可能是同名异物菌株。说明草菇菌种不同生产厂家相互引种后又各自保藏命名，存在同名异物、同物异名现象。

3 讨论

以自然生态环境和传统农艺为基础发展起来的草菇产业，菌种是最重要的基础材料，尤其是“南菇北移”的高温菇种草菇[9]。黑龙江使用的生产菌株均是引种所得，菌种选择是关系生产成败和提高栽培效益的一项重要措施。通过将表观形态与ISSR 分子标记技术相结合，确认25 个草菇菌株间亲缘关系，将以此为依据初筛出作为栽培试验的生产菌株。

草菇菌种应用传统的形态学方法鉴定，易受环境因素影响，而且草菇菌株个体分化程度低，可供选择的特征性状有限，形态学区别不大[10]。通过使用cPDA 培养基，30℃恒温培养条件下，依据草菇的表观形态将25 个供试草菇菌株划分成4 个组群。

ISSR 分子标记是直接从DNA 水平上检测基因组DNA 的多态性，不受环境条件和发育阶段的影响[11-13]，扩增条带清晰、多态性强、重复性好，结果统计时主观判断少。在黑木耳[14]、草菇[15]、羊肚菌[16]、杏鲍菇[17]、香菇[18]、姬松茸[19]等食用菌品种的鉴定及亲缘关系研究中已有成功报道。在ISSR 分析中，在遗传相似水平为0.90 时将25 个供试草菇菌株划分成8 个组群，与表观形态划分的组群相比，是将表观形态划分的4 个组群又进行进一步的细化分组。以表观形态为依据划分出的第1 组群，ISSR分子技术将其细分成3 个组群；以表观形态划分出的第3 组群和第4 组群，与ISSR 分子标记划分组一致；表观形态划分出的第2 组群，ISSR 分子标记将其划分为4 个组群，其中18 号菌株与以表观形态看划分的第3 组群的4 号、6 号、13 号和15 号归为一群，与表观形态归类有差异。以此次草菇菌株遗传多样性分析为依据选出18 个菌株进行栽培比较试验，初步筛选出2 号、5 号、11 号和23 号4 个菌株耐低温能力强，棚室内保持温度在24℃以上即可正产出菇，可在寒区推广应用。这四个菌株，分属于聚类分析中的4 个组群，特别是2 号菌株与其他菌株间相似系数为0.80，说明所选菌株具有一定的遗传多样性。