自噬对椎间盘退行性变作用机制的研究进展

胡舜琪，张其琛，李熙雷

复旦大学附属中山医院骨科，上海 200032

椎间盘退行性变（IDD）被公认为是腰痛的主要原因，约有80%的人会在其一生中遭遇到腰痛［1］。目前，世界上约有6.5亿人受到腰痛的困扰，仅在美国，每年投入的相关费用就超过了300亿美元，甚至超过了中风、呼吸道感染、糖尿病、冠状动脉疾病及类风湿疾病的费用总和［2］。腰痛已是导致患者住院治疗的第二大常见病因，也是导致患者长期残疾的主要原因之一［3］。此外，IDD还是颈部和背部疼痛综合征的主要原因，严重情况下甚至会造成患者残疾［4］。随着人口老龄化的日渐加重，IDD对人类健康造成巨大危害，也给患者家庭和社会增加了沉重的经济负担。作为一种常见的复杂退行性疾病，其传统治疗措施已无法满足目前的临床需求。自噬细胞保护效应引起学者们的关注。椎间盘髓核细胞通过自噬适应外界环境，维持细胞稳态。适度激活自噬能有效抑制椎间盘细胞凋亡，延缓细胞外基质（ECM）降解。研究自噬在IDD中的作用机制，针对性地干预其病理生理进程，可为IDD的临床治疗提供新的理念。本文通过查阅近年自噬对IDD作用的相关文献，从IDD及自噬的发生机制、髓核细胞凋亡途径及自噬对髓核细胞凋亡的作用机制等方面展开分析，综述如下。

1 IDD的发生机制

目前，IDD的治疗主要依靠手术缓解神经受压，有一定的疗效，但无法从根本上预防或逆转IDD的发生和发展［5］。面对现有治疗的局限性，深入研究IDD的发生机制，寻找新的解决方案成为迫切需求。椎间盘活性细胞数量的减少和ECM的降解是IDD的主要特征。在健康的椎间盘中，由于受到生长因子和细胞因子的复杂调控，ECM的合成和分解代谢处于相对平衡的状态；一旦ECM的分解代谢超过合成代谢，就容易发生IDD。IDD的发生机制非常复杂，常由多个因素引起，如异常的机械负荷、性别、年龄、吸烟、创伤和遗传等［6-9］。健康的椎间盘需要维持细胞稳态，当细胞稳态由于上述因素被破坏时，在分子水平上会发生分解代谢的级联反应，进而导致促炎因子水平上调、基质降解酶增加和基质蛋白丧失，加剧IDD发展，甚至导致神经血管向椎间盘内生长，引起疼痛症状［10］。研究表明，ECM中的胶原蛋白和蛋白多糖的丧失在IDD的发展中起到关键作用，ECM的分解过程由基质金属蛋白酶（MMP）和血小板反应蛋白解聚素样金属蛋白酶（ADAMTS）引起［11］，该过程被认为由肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子介导，其上调了MMPs和ADAMTS的表达［12］。在这些分子中，MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4及ADAMTS-5是降解基质成分的典型代表，已被证实在发生退行性变的组织中高表达并参与了正常细胞的转化和椎间盘主要结构成分的病理性退行性变［13］。此外，椎间盘细胞的死亡，尤其是髓核细胞的凋亡也会导致ECM的合成与分泌减少。

2 自噬的发生机制

自噬是细胞的自我消化，是一种进化上极为保守的分解代谢过程，最早由De Duve［14］于1963年提出。自噬分为3种形式：巨自噬、微自噬及分子伴侣介导的自噬（CMA）。一般所说的自噬即为巨自噬。自噬是细胞的一种自我保护机制，通过该机制，在不利的外界条件下，例如营养缺乏、氧化应激等，细胞中受损的细胞器或长寿命蛋白可以被双层膜囊泡隔离并带到溶酶体中降解。自噬在所有细胞中以较低的基础水平存在来维持细胞稳态，如更新细胞器；当细胞需要产生营养、能量（如饥饿或营养因子缺乏）或需要迅速清除有害的细胞质中的成分（如在氧化应激或感染期间），自噬水平会快速上调。细胞通过自噬来降解非必需蛋白质和细胞器，以供细胞重新回收利用，再合成细胞所需的大分子和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）［15］。在不同的应激下，细胞依靠自噬清除功能失调或过剩的细胞器来维持细胞稳态［16］。自噬的过程可分为以下几个步骤。

2.1 自噬的起始与成核

自噬的激活途径包括哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）依赖性途径（如AMPK/mTOR和PI3K/Akt/mTOR）以及非mTOR依赖性途径（如p53）。自噬的特异性和复杂的分子机制尚未完全阐明，已被认为有超过35种自噬相关基因（ATGs）参与自噬的调控［17］。在哺乳动物中，mTOR的下调受到应激的刺激，随后激活下游的丝氨酸/苏氨酸Unc-51样激酶1（ULK1）和ULK2（ATG1在哺乳动物中的2个同源物）。激活的ULK1/2与ATG13、FIP2000（ATG17在哺乳动物中的同源物）和ATG101形成ULK1复合物，通过激活Ⅲ类磷脂酰肌醇3激酶（PI3KC3）复合物来调控自噬体的形成［18］。PI3KC3复合物通过磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）的产生来募集效应蛋白，形成欧米茄体，即自噬前体（PAS）作为成核位点［17］。

2.2 自噬体膜的扩增和延伸

PI3KC3复合物定位于吞噬泡并进一步募集ATGs以完成自噬体的发育。吞噬泡的延伸会受到2种泛素样结合系统的调控：①ATG5-ATG12复合物与ATG16L1结合，产生定位于膜外表面的复合物，称为ATG16L复合物［19］。ATG12通过E1样酶ATG7和E2样酶ATG10与ATG5共价结合，得到的ATG5-ATG12复合物被募集到自噬体膜并通过与ATG16L1的相互作用促进其延伸［20］。②涉及微管相关蛋白1轻链3（LC3），其为酵母中ATG8的同源物。早期合成的无活性proLC3（LC3的未加工形式）被ATG4B裂解，形成可溶性的LC3-Ⅰ，从而暴露其C末端的甘氨酸基团［21］。LC3-Ⅰ的C末端甘氨酸基团与磷脂酰乙醇胺（PE）的特异性氨基酸位点紧密结合，形成LC3-PE复合物，这种形式的LC3被称为膜结合的LC3-Ⅱ［22］。蛋白质免疫印迹法分析LC3-Ⅱ水平的变化或监测细胞中GFP-LC3的分布是测定自噬水平最常用的方法［23］。PE的高亲脂性促进LC3-Ⅱ募集自噬体，在自噬体的延伸中起到了决定性作用［24］。这2种系统对自噬发生均不可或缺。ATG16L复合物作为一种新型E3样酶，对LC3的脂质化起到了支架作用，最终促进自噬体形成［19］。

2.3 自噬溶酶体的形成及内容物降解

随着膜的扩增和封闭，自噬体逐渐成熟。当自噬体完全封闭底物，就可与溶酶体融合，形成自噬溶酶体。自噬体与溶酶体融合之后，位于自噬体膜外的LC3-Ⅱ通过ATG4与PE解偶联，形成LC3-Ⅰ并被释放到细胞质中进行再次循环，而定位于自噬体膜内的LC3-Ⅱ最终被自噬溶酶体的酸性水解酶迅速降解。

3 髓核细胞凋亡途径

细胞凋亡的研究主要集中在3种凋亡信号通路：线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径。Wang等［25］的研究证实，在发生退行性变的椎间盘组织中，以上3种途径共同导致了细胞凋亡的发生。在IDD发展的轻度阶段，内质网途径介导的髓核细胞凋亡占主导地位；死亡受体途径则在轻度、中度IDD中发挥主要作用；线粒体途径在重度IDD中起到更关键的作用。

这3条凋亡路径相互之间也存在着密切的分子交联。Caspase-8连接死亡受体和线粒体途径［26］；p53也可以通过上述的2个途径起作用［27］，在间接的线粒体途径中，p53导致细胞质的Fas在细胞表面重新分布，并上调Fas表达，而Fas是死亡受体途径中的重要分子。在直接线粒体途径中，p53上调Bax并使功能性Bax和Bcl-x复合物解离［28］，因此，死亡受体和线粒体途径也通过p53连接。内质网途径和线粒体途径可以通过GADD153和caspase-9联系［29］。尽管这3种途径存在许多交联，但死亡受体、线粒体和内质网途径的特异性标志物各不相同，分别是Caspase-8、Cytc和Caspase-4。髓核细胞的凋亡发生率随着IDD的进展而增加，在IDD过程中，每个凋亡路径在IDD的不同阶段发挥不同作用。

4 自噬对髓核细胞凋亡的作用机制

在成年人的正常椎间盘中几乎没有血管存在，并且髓核细胞在椎间盘中处于极度缺氧的状态（中心的髓核氧浓度仅为1%）［30］，因此，椎间盘本身易发生退行性变。若存在非生理性的机械负荷及其他生理生化因素的刺激（如衰老、尼古丁、炎性因子等），就会诱导椎间盘细胞的凋亡，而大量凋亡的髓核细胞和ECM的分解产物则可进一步促进髓核组织中炎性因子的增加［31-32］，形成恶性循环。髓核细胞是存在于椎间盘髓核中的主要细胞类型，负责合成ECM成分，例如Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖，这些蛋白是椎间盘主要的功能组成部分。不仅凋亡的髓核细胞无法合成ECM，在椎间盘中经历退行性变过程的存活细胞也无法合成正常的ECM［33］。有研究显示，在细胞水平，凋亡与IDD密切相关，如在老化的椎间盘中，髓核组织的凋亡率显著增加［34］。因此，与凋亡相关的髓核细胞减少是IDD的起始触发因素，如何有效地抑制髓核细胞的凋亡是解决问题的关键。

研究表明，自噬与细胞死亡密切相关，与自噬有关的细胞死亡被细胞死亡命名委员会（NCDD）称为“自噬性细胞死亡”［35］。事实上，自噬性细胞死亡和凋亡均属于程序性细胞死亡（PCD）的范畴［36］。从分子机制层面看，自噬也与细胞凋亡存在着复杂紧密的联系。Beclin-1是酵母自噬相关基因6（ATG6）的哺乳动物同源物，在自噬过程中发挥关键作用，已有证据显示，抗凋亡因子B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）基因可通过结合Beclin-1的BH3结构域抑制自噬［37］。此外，ATG12和ATG5在不同应激信号引起的细胞凋亡的启动中扮演了重要角色［38］。自噬能否影响椎间盘中的细胞凋亡，引起了学者们的极大兴趣。

研究发现，自噬在未发生退行性变的大鼠椎间盘髓核细胞中存在着一定的基础水平，而在发生退行性病变的髓核组织中细胞自噬显著增高或降低，说明自噬在正常髓核细胞及不同病理因素背景下发挥不同的作用［4］。

Jiang等［39］的研究发现，葡萄糖胺可通过PI3K/Akt/mTOR通路激活自噬，在10 mmol/L葡萄糖胺的浓度下，炎性因子IL-1β处理过的髓核细胞的Caspase3/pro-caspase3显著降低，说明髓核细胞的凋亡被该浓度下葡萄糖胺所诱导的自噬抑制。然而在高浓度葡萄糖胺下，自噬被过度激活，引起髓核细胞自噬性细胞死亡；另外，用自噬抑制剂3-MA可以使细胞凋亡加剧。这说明中等程度的自噬激活有利于髓核细胞的生存，过低或过高水平的自噬均会加剧髓核细胞的死亡。

同时有研究显示，外界刺激持续作用的时间也会通过自噬影响髓核细胞的活力。Ma等［40］通过压缩诱导髓核细胞自噬，随着暴露于压缩刺激的时间延长，自噬增加，凋亡水平也呈时间依赖性增加。这说明外界持续刺激诱导的长期自噬不利于细胞存活。Chang等［41］的研究发现，通过葡萄糖剥夺，早期（0 ～ 6 h）由少量活性氧类（ROS）产生所诱导的自噬对细胞的保护起到关键作用，在晚期阶段（12 ～ 24 h）过量的ROS累积反而造成细胞器的损伤，此时自噬的保护作用无法与之抗衡，导致髓核细胞凋亡增加。有学者认为，自噬引起的细胞内资源的过度消耗也可能是导致细胞死亡的一个重要原因［42］。

自噬激活的作用效果也与椎间盘本身的退行性变程度有关。Miyazaki等［43］的研究发现，自噬在PfirrmannⅣ级椎间盘中抑制凋亡的效果比PfirrmannⅡ级更明显，而且自噬在晚期退行性变的椎间盘中的作用比在早期更为突出。因此，可以推断，退行性变程度越高的椎间盘，其细胞对自噬激活的敏感性可能更高。由此可见，自噬对髓核细胞而言是一把双刃剑，是髓核细胞存活和死亡之间的转换器。自噬的适度激活有利于改善髓核细胞活力，减少髓核细胞在不利应激下的凋亡率。

5 总 结

IDD的传统治疗已无法满足患者对预后的期望和对生活质量的需求。近年来，自噬作为一个科研热点引起了广泛的关注和深入探索。目前，大部分研究依然处于体外试验阶段，其确切的临床效果尚有待验证。如何将椎间盘细胞的自噬水平调控至最佳以最大程度降低细胞凋亡，是临床应用的重大挑战，但可以预见的是，以自噬相关通路作为靶点的疗法，将为IDD的临床治疗提供更多的选择。