Ⅱ型牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定

范峻豪，赵洪哲，王 昊，张 静，王凤雪，温永俊

（内蒙古农业大学兽医学院 农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特 010018）

牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）属黄病毒科、瘟病毒属，为单股正链RNA病毒[1]，是引起牛呼吸道疾病、肠炎和免疫功能障碍的重要病原体。BVDV可以穿过胎盘并感染胎儿，导致母畜流产、胎儿先天畸形或持续感染（persistent infection，PI）牛的出生[2]。易感母畜在妊娠早期感染非致细胞病变的BVDV，并在妊娠早期变成病毒血症，胎儿在其免疫系统成熟之前感染时，会产生持续感染[3]。PI牛的BVDV抗体呈阴性，维持终身病毒血症，并不断将病毒传播到环境中，成为病毒的主要储存库，PI牛是易感牛的主要传播来源[4]。

5"-UTR（5"非翻译区）在BVDV各毒株间高度保守，根据5"-UTR的差异将其分为BVDV-Ⅰ型和BVDV-Ⅱ型两种基因型[5]，因此也常根据该区域对BVDV进行鉴定。根据是否致细胞病变（cytopathic effect，CPE），将BVDV分为致细胞病变型（CP型）和非致细胞病变型（NCP型）两种生物型。而BVDV的持续感染主要由NCP型造成[6]，有研究表明细胞病变的程度不能决定病毒毒力，反而NCP型毒力更强，当PI牛在生长发育过程中被CP型BVDV超感染将会引发严重的黏膜病[7]，给养牛业带来严重危害。而牛血清在生物制品行业中应用广泛，如果血清中有NCP型BVDV感染，科研人员培养的细胞甚至研发的疫苗都存在污染的可能，对生物制品行业有很大的安全隐患。

本研究对2017年从屠宰场采集的32份牛肺脏样品进行分离鉴定，分离到两株可能为NCP型的BVDV-Ⅱ型毒株，命名为BVDV-HT1704、BVDVHT1723株。本研究对了解BVDV的流行情况、地理分布提供依据，并为疫苗的研发具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞和样品来源BVDV-296阳性毒株、MDBK细胞为内蒙古农业大学传染病教研室保存，牛肺脏样品采自内蒙古自治区呼和浩特市某屠宰场。

1.2 主要试剂2×Easy Taq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；M-MLV Reverse Transcriptase购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；RNAiso Plus、DNA Marker、dNTP、RRI、Random Primer、pMD19-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；DMEM、青链霉素混合液购自Gibico公司；胎牛血清、马血清购自Hyclone公司；抗BVDV单克隆抗体为本实验室自制；其他常规试剂，均为国产分析纯。

1.3 样品处理将采集的牛肺脏样品剪碎置于研钵中，倒入液氮将组织研磨成粉末，加入5倍体积含1%工作浓度双抗的DMEM培养基，充分研磨制成匀浆液，反复冻融3次，使病毒粒子完全释放。4℃条件下，5 000 r/min离心10 min，吸取上清备用。

1.4 肺脏组织中BVDV基因组RNA的提取及反转录参照RNAiso Plus试剂说明提取肺脏组织中BVDV基因组的总RNA，并用12 μLDEPC水溶解后，立即进行反转录制备其cDNA，以cDNA为模版扩增BVDV的5"-UTR。反转录体系（25 μL）：总RNA 11 μL，Random Primer 2.0 μL混匀，70℃孵育10 min，冰浴5 min；再加入5× M-MLV buffer 5.0 μL、10 mmol/L dNTPs 5.0 μL、M-MLV 1.0 μL、RRI 1.0 μL，充分混匀后离心，置于42℃温浴90 min，-20℃保存。

1.5 肺脏组织中BVDV的RT-PCR检测利用本实验室建立的扩增BVDV 5"-UTR的1对特异性鉴定引物，上游引物-F：5"-TAGCCATGCCCTTAGTAGGA C-3"；下游引物-R：5"-CTCCATGTGCCATGTACA GCA-3"，引物由吉林库美生物公司合成。PCR反应体系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，Rnase-Free ddH2O 9.5 μL，上、下游引物 （10 μmol/L）1.0 μL，cDNA模板 1.0 μL。反应参数为：94℃预变性7 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸35 s，35个循环；72℃再延伸 10 min。对扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。同时，将目的片段克隆至pMD19-T载体中，阳性质粒送由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.6 肺脏组织中BVDV培养及传代复苏MDBK细胞，用含8%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基于37℃、5%CO2的培养箱中进行传代培养，待细胞长成单层后，用于病毒接种。将研磨的组织上清经0.22 μm滤器过滤除菌，接种于单层处于生长对数期的MDBK细胞，37℃感做2 h，补加含有2%马血清、1%双抗的细胞维持液，置于CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变。盲传5代后进行RT-PCR检测，阳性样品继续传代，盲传至10代后再进行RTPCR检测。

1.7 BVDV分离株免疫荧光检测将盲传10代的病毒接种于96孔板培养的单层MDBK细胞，接种3 d后使用4%多聚甲醛固定1 h，孵育FITC标记的单克隆抗体（MAb）进行直接免疫荧光试验，同时设BVDV-296毒株阳性对照和阴性对照。

1.8 BVDV分离株5"-UTR遗传进化分析利用分子生物学软件对分离株5"-UTR序列进行分析，利用MEGA7.0软件按Neighbor-Joining法构建系统发育进化树，系统发生统计学方法利用1000 bootstrap进行计算，根据进化树的结果确定分离株的基因型。

图1 RT-PCR 检测结果Fig.1 Amplification of 5"-UTR fragment in BVDV

2 结果

2.1 肺脏组织中的BVDV RT-PCR鉴定结果将牛肺脏样品RT-PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳，使用凝胶成像系统进行观察。结果显示，扩增得到一条约为288 bp的特异性条带，与预期大小相符（图1A）。对盲传5代及10代的细胞培养物进行RT-PCR鉴定，结果与肺脏样品RT-PCR扩增结果一致（图1B、C）。将扩增片段的测序结果在GenBank上进行Blast比对，结果表明，两株分离株为BVDV，命名为BVDV-HT1704、BVDVHT1723株。

2.2 肺脏组织中的BVDV分离培养将RT-PCR检测为阳性的肺脏样品接种于MDBK细胞后，每天观察细胞病变，接种至第4 d未出现细胞病变，仅有部分细胞脱落、死亡，而贴壁细胞生长正常。阴性对照细胞生长正常，阳性对照细胞出现圆缩、细胞融合、呈拉网状并形成空泡。表明分离到的病毒株可能为不导致细胞病变的NCP型BVDV病毒株。

2.3 分离株BVDV直接免疫荧光检测结果BVDV的RNA复制在细胞胞浆内质网上进行，荧光显微镜下可在接种BVDV-296株和BVDV分离株的MDBK细胞胞浆中观察到特异性荧光，而未接种病毒的正常细胞无荧光（图2），表明能从肺脏组织中分离到BVDV。

2.4 BVDV5"-UTR遗传进化分析结果应用BVDVHT1704、BVDV-HT1723株的5"-UTR序列与BVDV参考毒株的相应序列进行进化树分析，所选毒株均为参考毒株和近年流行毒株。分析结果显示，两株分离株与美国分离的USMARC-60779和USMARC-60767两株病毒进化关系较为密切，同处于一独立分支（图3），表明分离株为BVDVⅡa型。其与USMARC-60767毒株的Bootstrap值为51%，表明两分离株可能分属于单一的分支，对该分离株的分析还有待于进一步研究。

图2 BVDV 分离株的直接免疫荧光鉴定Fig.2 Identification of BVDV isolates cultured in MDBK cells by DFA

3 讨论

BVDV对任何年龄牛均易感，可造成严重的呼吸道系统疾病、生殖系统疾病、免疫系统紊乱及免疫抑制等。感染牛以发热、腹泻、黏膜溃疡为主要临床症状，患病母牛出现流产、死胎及胎儿畸形 等[8]。牛病毒性腹泻病虽危害严重，但仍没有引起人们对此病的足够重视。近些年的流行病学调查显示，我国大型牛场的BVDV感染呈上升趋势，有些牛场的抗体阳性率甚至在90%以上，造成严重的经济损失[9]。我国尚未从分子水平上对BVDV分离株的基因型进行明确定义，并且国内BVDV-Ⅱ型流行现状以及分离株特性不明确[10]，严重影响对该病的防控。

NCP型BVDV感染怀孕早期母畜，病毒可穿过胎盘引起胎儿感染，造成死胎、流产、免疫力低。感染母畜产下的正常胎儿将成为持续感染牛，是牛群中BVDV的主要传染源。本研究从无临床症状牛体内采取无病理变化的肺脏组织，意在对BVDV非致细胞病变型的持续感染情况进行调查。本研究首次从正常组织样品中分离到BVDV-Ⅱa型NCP型毒株，说明BVDV的持续感染情况在牧场中存在，如不针对持续感染牛进行筛查，BVDV的流行情况将呈现上升趋势，因此，应该对该病的防控加以重视。根据近年来的流行病学发现，BVDV-Ⅰ型为我国主要流行毒株，而Ⅱ型毒株流行较少。进化树分析表明，分离株与美国分离株进化关系较密切，与中国分离株亲缘关系较远，可能是由于从国外引进牛数量的增加促进了BVDV在我国的传播。BVDV诊断试剂及疫苗的研发是防控该病的主要手段，对持续感染牛的检疫是防控该病的中心环节，扑杀持续感染牛、接种防疫疫苗并结合流行病学的检测等措施的实施，定能将该病的发生限制在可接受的范围内，降低疾病发生带来的经济损失。

图3 BVDV 分离株5"-UTR 基因进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on BVDV 5"-UTR