外周血CD3＋T淋巴细胞对习惯性流产患者不良妊娠的预测价值

李慧，廖碧翎，林小红

（广东省妇幼保健院妇产科，广州 510010）

习惯性流产（RPL）是指妇女与同一性伴侣发生连续3次以上的妊娠胚胎丢失。RPL发生率为1%～5%［1］，已成为临床上最常见的不育症之一；其治疗难度大，给产妇和家庭带来极大的身心伤害。RPL的发病机制非常复杂，可能的诱因包括子宫畸形、遗传因素、免疫异常、感染等［2］。最新研究表明，T淋巴细胞介导的母胎界面免疫异常可能与RPL的发生有关［3］。妊娠状态类似于同种异体移植过程［4］，母胎界面的免疫耐受使胚胎不被母体排斥；当免疫耐受破坏后，母体对胚胎产生排斥反应，最终导致流产。T淋巴细胞是一组来源于骨髓的多功能干细胞，按照表面CD抗原分为不同的亚群；其中CD3＋T细胞几乎存在于所有T细胞表面，是成熟T细胞的主要标记物［5］。研究表明，RPL患者外周血CD3＋细胞明显高于正常孕妇，正常孕妇孕前CD3＋细胞水平升高是孕期流产的高危险因素［6－7］。本研究通过分析RPL再次受孕患者和正常孕妇早孕期CD3＋细胞水平的差异，并随访妊娠结局，旨在评价CD3＋细胞对RPL患者不良妊娠的预测价值。

资料与方法

一、一般资料

选择2017年12月至2018年10月就诊于我院妇产科的RPL再次妊娠早孕期患者60例为研究对象，年龄20～36（28．5±3．9）岁。纳入标准：本次受孕前发生3次以上自然流产的育龄妇女，患者及配偶间无染色体异常，患者性伴侣精液检查正常。排除标准：生殖道畸形，内分泌疾病，血小板增多症或血栓前状态，自身免疫性疾病，全身或局部感染，阴道霉菌、衣原体、支原体或滴虫阳性，异位妊娠，生化妊娠，妊娠滋养细胞疾病。

选择同期于我院常规产检的无既往自然流产史正常早孕妇女50例为对照组，年龄20～39（28．6±4．7）岁。研究对象均经血HCG、B超检查证实本次妊娠。本研究经我院医学伦理委员会批准，研究前征得所有孕妇同意，并签署知情同意书。

二、研究方法

1．研究试剂与仪器：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD3单克隆抗体、别藻蓝蛋白（APC）标记的小鼠抗人CD4单克隆抗体、藻红蛋白（PE）标记的小鼠抗人CD8单克隆抗体均购自丹科医疗器械技术服务（上海）有限公司；FACSAria II流式细胞仪（BD，美国）；溶血素、肝素抗凝管（BD，美国）。

2．样本采集：两组患者均于早孕期抽取新鲜外周血1ml，RPL组抽血时停经时间39～68（53．6±5．6）d，对照组为39～74（54．6±7．5）d。血液样本采集后置于肝素抗凝管，轻轻混匀3～5次，贴上相应标签，常温送检。

3．流式细胞仪检测外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T细胞数量：取50μl外周血，分别加入10μl FITC－CD3单克隆抗体、10μl APC－CD4单克隆抗体和10μl PE－CD8单克隆抗体，避光反应20min。加入1ml溶血素，避光反应20min，2 500rpm离心5min，弃去上清液。加入200μl磷酸盐缓冲液轻轻振荡混匀，2 500rpm离心5min，弃去上清液，载入加入200μl磷酸盐缓冲液。利用流式细胞仪检测CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T细胞数量，检测操作参考仪器及试剂盒说明书。

4．资料收集与随访：记录RPL组和对照组年龄、体重指数（BMI）、孕次、产次、停经时间以及外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T细胞数量。随访孕妇妊娠结局，按照是否成功分娩分为RPL成功分娩组（24例）、RPL再次流产组（36例）和正常成功分娩组（48例），分析影响RPL再次流产的危险因素。

三、统计学方法

采用SPSS 19．0软件处理数据。计数资料用百分比表示，组间比较采用χ2检验。符合正态分布的计量资料用均数±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验，3组间比较采用单因素方差分析。采用Logistic回归模型分析影响RPL患者不良妊娠的独立危险因素。利用受试者工作曲线（ROC）及曲线下面积（AUC）评价CD3＋T细胞对RPL患者不良妊娠的预测价值。P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

一、随访结果

RPL组患者中24例成功分娩，36例再次流产；对照组1例失访，1例自然流产，其余48例成功分娩。3组间年龄、BMI、产次、采血时停经时间等一般资料比较均无统计学差异（P＞0．05），RPL再次流产组、RPL成功分娩组孕次显著高于正常成功分娩组（P＜0．001）（表1）。

表1 各组一般资料比较（）

表1 各组一般资料比较（）

注：与正常成功分娩组比较，＊P＜0．001

组 别 例数 年龄 BMI（kg／m2） 孕次 产次 停经时间（d）RPL再次流产组 24 28．1±3．9 21．44±2．33 3．22±0．42＊ 0．11±0．32 53．0±5．7 RPL成功分娩组 36 29．2±3．9 22．05±2．31 3．17±0．48＊ 0．13±0．34 54．5±5．4正常成功分娩组 48 28．7±4．8 21．12±1．84 0．19±0．39 0．19±0．39 54．8±7．6

二、3组孕妇外周血免疫细胞比值比较

RPL再次流产组外周血CD3＋和CD3＋CD4＋T细胞比值显著高于RPL成功分娩组和正常成功分娩组（P＜0．05）；RPL成功分娩组外周血CD3＋T细胞比值显著高于正常成功分娩组（P＜0．05），但两组间CD3＋CD4＋T细胞比值差异无统计学意义（P＞0．05）；3组间CD3＋CD8＋T细胞比值相比较，差异无统计学意义（P＞0．05）（图1、2）。

图1 各组孕妇外周血CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋T细胞比值比较

图2 孕妇CD3＋流式检测散点图

三、RPL再次流产危险因素分析

单因素和多因素Logistic回归分析显示，CD3＋、CD3＋CD4＋T细胞是影响RPL患者再次流产的独立危险因素（均P＜0．05）（表2、3）。

四、CD3＋T细胞预测RPL患者再次流产的ROC曲线

CD3＋T细胞临界值为79．02%时，预测RPL患者再次流产的AUC为0．836［95%CI（0．717，0．919）］，显著高于CD3＋CD4＋T细胞［AUC＝0．630，95%CI（0．495，0．751）］（Z＝2．432，P＝0．015），对应的特异性为91．7%，敏感性为63．9%（图3）。

表2 RPL 再次流产危险因素赋值

表3 RPL再次流产危险因素Logistic回归分析

图3 CD3＋和CD3＋CD4＋T细胞预测RPL患者再次流产的ROC曲线

讨 论

生理妊娠类似于同种异体移植，整个妊娠过程即是母体对胚胎免疫耐受的过程。正常情况下，胚胎作为同种异体移植物，可以存活至分娩结束。在妊娠的任何阶段，母体自身免疫功能发生改变，会破坏母体和胚胎之间的免疫耐受平衡，导致胚胎移植失败而发生流产［8］。T淋巴细胞是机体重要的免疫调节细胞，在机体体液免疫中发挥重要作用。研究表明，T淋巴细胞与生殖免疫有关，T淋巴细胞亚群的平衡对正常妊娠有着重要作用，一旦平衡被打破，即可引起母胎之间免疫失衡，最终导致妊娠失败［9］。

T淋巴细胞介导的生殖免疫机制较为复杂，目前已知妊娠母体的胚胎基因有一半来自于父系；由于胚胎细胞表达了异体抗原，使母胎之间发生免疫排斥，因此母体需要发生免疫耐受才能避免胚胎被母体排斥，从而维持正常妊娠过程［10］。T淋巴细胞介导了由胚胎诱导的母胎天然免疫反应，CD3＋几乎表达于所有成熟T细胞表面，是T细胞的主要表面标志。既往研究表明，CD3＋T细胞产生的细胞因子可以直接影响滋养细胞的分化和增殖，从而影响胚胎的发育［11］。此外，CD3＋T细胞还可能通过血小板活化和血栓形成，诱发血栓性事件而导致妊娠失败［12］。本研究显示，无论是否成功分娩，RPL患者外周血CD3＋T细胞明显高于正常成功分娩组，并且RPL再次流产组外周血CD3＋T细胞明显高于RPL成功分娩组，提示CD3＋T细胞升高可能与RPL发生和RPL不良妊娠结局有关。

研究表明，伴胰岛素抵抗的RPL患者外周血CD3＋和CD3＋CD4＋T细胞水平明显升高，且CD4＋T细胞异常的患者更容易发生反复自然流产［12－13］。Wang等［14］称孕妇CD4＋T细胞增多时，会增强母体对胚胎的免疫排斥反应，而CD8＋T细胞会抑制CD4＋T细胞介导的细胞免疫，因此CD4＋／CD8＋T比值稳定对维持正常妊娠起着重要作用。Kwiatek等［15］研究显示CD3＋CD4＋T细胞升高可以增强母体的免疫功能，导致母胎排斥反应而诱发流产。在正常妊娠过程中，CD3＋CD4＋／CD3＋CD8＋比值（Th／Ts）保持动态平衡，从而维持正常妊娠［16］。本研究发现，RPL再次流产组外周血CD3＋CD4＋T细胞明显高于RPL成功分娩组和正常成功分娩组，但是3组CD3＋CD8＋T细胞差异无统计学意义，提示CD3＋CD4＋T细胞升高可能与RPL不良妊娠有关，而CD3＋CD8＋T细胞与RPL患者妊娠结局无关。目前关于CD3＋CD8＋T细胞对妊娠结局的影响争议较大，梁仲城等［17］称反复流产患者明确存在外周血中T细胞、NK细胞、CD4／CD8含量分布及T细胞CD4CD25异常表达。Grimstad等［18］则在研究中发现流产和成功分娩的反复自然流产患者在妊娠早期CD3＋CD8＋无明显变化。CD3＋CD8＋在RPL患者分娩结局中的作用仍需要进一步研究。

本研究采用多因素回归分析影响RPL患者再次流产的危险因素，结果显示CD3＋、CD3＋CD4＋T细胞是影响RPL患者再次流产的独立危险因素。ROC分析显示CD3＋T细胞预测RPL不良妊娠结局的AUC显著高于CD3＋CD4＋T细胞（0．836vs．0．630），其临界值为79．02%，说明妊娠早期CD3＋T细胞高于79．02%的RPL患者再次流产的风险明显升高。Talukdar等［19］报道称孕妇妊娠前高CD3＋T细胞水平是妊娠后流产的危险因素。Du等［20］认为无论妊娠结局如何，孕妇妊娠后外周血CD3＋T细胞明显高于妊娠前，提示CD3＋T细胞与妊娠过程有关。本研究由于受试对象入选时间原因，未分析RPL患者妊娠前后血清CD3＋T细胞变化情况，在接下来的研究中我们也将在这方面做一些深入探讨。

综上所述，RPL患者再次妊娠早孕期检测外周血CD3＋T细胞将有助于预测患者妊娠结局。