解冻周期单囊胚移植与卵裂期双胚胎移植的比较：一项关于反复种植失败周期的研究

刘卫卫，韩伟，高洋，郝向伟，黄国宁

（重庆市妇幼保健院遗传与生殖研究所，重庆 400013）

在辅助生殖领域，反复种植失败（Recurrent implantation failure，RIF）有多种定义，但通常指实施移植3次或3次以上形态学评分较高的胚胎而未获得临床妊娠［1－4］。RIF的主要原因包括母体因素和胚胎因素［5］。母体因素主要包括子宫异常和母体的异常血栓状态或免疫反应状态等［6－8］；胚胎因素可能是起源于配子或合子发育异常而导致的胚胎染色体异常［9］。

目前，为了改善RIF的胚胎因素，胚胎学家试图通过时差监测培养系统（Time－lapse Monitoring，TLM）、胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetics Screening，PGS）或囊胚培养来进一步优选胚胎。但TLM系统价格昂贵，并未在国内IVF实验室大规模的推广和使用。尽管RIF是实施PGS的指征，考虑到PGS的性价比和患者的接受度，也并未被广泛应用。囊胚培养，通过延长胚胎体外培养时间，进一步优选胚胎，是目前国内大多数IVF实验室可以实施且多数RIF患者可以接受的措施。有多个研究报道，在移植胚胎数目相同的情况下，囊胚移植与卵裂期胚胎移植相比，能够显著提高助孕患者的临床妊娠率和种植率，且不增加围生期母体和围生儿的不良结局［10－12］。但对RIF患者的囊胚期移植与卵裂期胚胎移植比较的研究相对较少，尤其是解冻周期中单囊胚移植与卵裂期双胚胎移植的研究鲜有报道。

本研究从IVF实验室角度，回顾性分析我中心2016年1月至2017年12月原因不明RIF且剩余有冷冻的囊胚期或卵裂期胚胎的患者资料，比较其解冻周期实施单囊胚期移植（Single blastocyst transfer，SBT）和卵 裂 期双 胚 胎移 植（Double cleavage－stage embryo transfer，DET）患者的临床条件及助孕结局，探讨解冻周期SBT是否能够提高该部分RIF患者的助孕结局。

资料和方法

一、研究对象

收集我中心2016年1月至2017年12月原因不明RIF且剩余有冻存囊胚期或卵裂期胚胎的患者资料，去除解冻周期双囊胚移植和卵裂期单胚胎及三胚胎移植周期后，本研究包括109例解冻周期SBT患者（SBT组）和336例解冻周期DET患者（DET组），排除1例SBT未复苏周期和3例DET未完全复苏周期。另外，本研究排除≥40岁的高龄患者、卵母细胞冻融周期和胚胎植入前遗传学诊断或筛查周期。

二、研究方法

1．胚胎培养和胚胎评估：采用我中心个体化降调节和促排卵方案，HCG注射后36～38h行采卵术（OPU），所获卵子按常规进行IVF／ICSI授精。授精后16～18h观察受精情况，并置于卵裂期胚胎培养基（G1＋5%HSA）（Vitrolife，瑞典）中继续培养48h后，根据患者临床条决定D3新鲜移植、卵裂期胚胎冷冻或囊胚培养后冷冻。实施囊胚培养的前提条件是D3冷冻卵裂期胚胎不少于4枚，剩余胚胎行囊胚培养，培养至D5／D6形成可用囊胚时冷冻保存。卵裂期胚胎评估依据传统形态学评分，包括卵裂速度、碎片程度、卵裂球均一度以及卵裂球出现单核或多核等。D3可用胚胎定义为卵裂球数目不少于6个，碎片少于30%且无明显形态学异常的胚胎。囊胚评估依据囊胚扩张度、内细胞团和滋养外胚层细胞的传统评分。D5／D6可用囊胚定义为扩张度≥3期且内细胞团和滋养层细胞至少一项优于C级的囊胚。

2．卵裂期胚胎和囊胚的冷冻和解冻：按照Kuwayama［13］报道的Crytop方法步骤及商品化试剂盒（Kitazato，日本）进行玻璃化冷冻和解冻。

3．胚胎移植和黄体支持：冻融周期采用人工替代周期。当子宫内膜厚度≥7mm，且无明显黄体过程时，给予孕酮黄体支持3d后实施胚胎解冻复苏。其黄体支持包括雌激素和孕激素的补充。对于解冻周期SBT，解冻1枚胚胎置于囊胚培养基（G2＋6%HSA）（Vitrolife，瑞典）中培养2～4h后移植；对于解冻周期DET，解冻2枚胚胎置于其上囊胚培养基过夜培养后移植。若妊娠确定，黄体支持应持续至妊娠10周左右。

4．比较指标：两组的比较指标主要包括临床妊娠率、种植率、多胎率和流产率。临床妊娠和种植是以胚胎移植后5周超声检查探及孕囊为标准。多胎是指胚胎移植后5周超声检查探及2个或2个以上的孕囊。流产是指临床妊娠28周之前的妊娠丢失。本研究中的率，根据情况，分别以移植周期数和妊娠例数为分母计算。

三、统计学分析

数据分析采用Stata 12．0软件。计量资料采用均数和标准差（）描述，计数资料用百分数描述。连续变量采用t检验，分类变量采用卡方检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般临床资料比较

两组患者的新鲜周期冷冻胚胎时年龄（新鲜周期卵龄）、不孕年限、体重指数（BMI）及解冻周期时子宫内膜厚度、既往ET周期次数、原发不孕比例和IVF授精比例均无统计学差异（P＞0．05）（表1）。

二、助孕结局比较

SBT组与DET组的临床妊娠率和种植率分别为（54．1%vs．47．6%）和（56．0%vs．30．1%），差异均无统计学意义（P＞0．05）。SBT组的流产率（2．8%vs．7．1%）低于DET组，差异无统计学意义（P＞0．05），但SBT组的多胎率显著低于DET组（P＜0．05）（表2）。

表1 SBT与DET的一般临床资料比较［（），n（%）］

表1 SBT与DET的一般临床资料比较［（），n（%）］

组 别 周期数 新鲜周期卵龄 （岁） 不孕年限 BMI（kg／m2）内膜厚度（mm）既往移植周期数 原发不孕 IVF授精SBT组 109 33．01±4．58 6．34±3．26 21．93±2．45 9．31±1．52 4．21±1．50 69（63．3） 87（79．8）DET组 336 33．01±4．48 6．27±3．31 22．09±2．61 9．34±1．47 4．42±1．43 227（67．6） 265（78．9）

表2 SBT与DET的助孕结局比较［n（%）］

讨 论

本研究回顾性分析本中心部分不明原因RIF患者解冻周期SBT与DET的临床资料和助孕结局。纳入患者中RIF均为临床检查中未明确特定原因的RIF。对特定原因的RIF患者，如夫妇一方存在染色体异常、母体存在自身免疫性疾病或子宫异常状态等，需要特定胚胎植入前遗传学诊断或相应的内科或外科专业治疗，均不属于本研究之列。另外，高龄（年龄≥40岁）患者胚胎非整倍体率明显升高，亦不属于本研究讨论范围。

本研究从胚胎因素着手，探讨对胚胎进一步筛选的囊胚培养能否改善不明原因的RIF患者的助孕结局。不明原因的RIF，多倾向于形成胚胎的配子（精子和卵母细胞）因素以及胚胎自身因素。有研究报道，精子DNA损伤与RIF相关，严重的精子DNA损伤导致囊胚孵出失败［14］。卵母细胞为胚胎提供一半遗传物质和全部能量供应，其线粒体数量和功能及其周围颗粒细胞的功能状态，与囊胚形成和胚胎发育密切相关［15－16］。李博等［17］报道胚胎因素（包括培养微环境、培养时间）在不明原因的RIF中发挥重要作用。多个报道包括系统回顾－Meta分析显示囊胚移植通过延长胚胎体外培养，在进一步筛选胚胎的同时，使胚胎发育阶段与子宫内膜相对同步，进而可提高胚胎种植率［12］。对不明原因的RIF患者，考虑其可能是精子、卵子或胚胎因素导致的胚胎自身缺陷，延长体外培养时间的囊胚培养有利于进一步胚胎筛选，从而改善该部分患者的助孕结局［18］。本研究的结果证实这种考虑的可能性，为不明原因RIF患者提供一种新的移植策略。

本研究属于回顾性研究，存在诸多局限性和缺点。首先，两组之间的样本量差别较大，使得统计的结果可能存在偏移。其次，实施囊胚培养的前提条件是D3冷冻卵裂期胚胎不少于4枚，剩余胚胎行囊胚培养，培养至D5／D6形成可用囊胚时冷冻保存，提示SBT组患者D3形成可用胚胎相对较多，其胚胎发育潜能相对较高，两组的前提条件可能存在差别，导致结果可能向SBT组偏移。另外，由于本中心新鲜移植周期实施卵裂期胚胎移植，极少实施新鲜囊胚移植，本研究仅涉及解冻移植周期，使得结果不够充分。因此，需要新鲜移植周期或解冻移植周期的前瞻性队列研究对本研究的结果进行验证。