囊胚发育速度及质量对冻融周期单囊胚选择的影响

王雪，肖亚玲，孙正怡，甄璟然，郁琦，邓成艳

（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院妇科内分泌与生殖中心，北京 100730）

在辅助生殖中，为了提高妊娠率往往会增加移植的胚胎数，但伴随而来的就是多胎妊娠的问题。多胎妊娠对母亲和新生儿的影响较大，如妊娠期并发症发生率、剖宫产率、早产率、小于胎龄儿发生率都显著高于单胎妊娠［1］。近年来随着辅助生殖技术（ART）的提高，妊娠率已经得到极大改善。所以现在很多中心开始降低移植的胚胎数，甚至单囊胚移植（Single embryo transfer，SET）［2－3］。相对于卵裂胚而言，囊胚培养有很多优点，囊胚在体外发育过程中跨越了8细胞阶段的发育阻滞，经过了一个再筛选的过程，从而囊胚移植后的种植率更高，有研究证实移植新鲜囊胚的妊娠结局优于卵裂期胚胎［4］。因此SET是降低多胎妊娠率的有效途径，而且有研究发现SET不会降低妊娠率和活产率［5－6］。因此如何挑选一个高发育潜能的囊胚对我们是一个极大的挑战。目前多数中心仍然采用形态学评分的方法来挑选需要移植的囊胚，然而胚胎从卵裂期发育至囊胚阶段的时间不一致，有的在获卵后第5天行成囊胚，有的要到第6天甚至第7天行成囊胚［7］。囊胚发育速度是否对妊娠结局产生影响产生较大的争议。在新鲜周期的研究中，D5囊胚的妊娠率要优于D6囊胚，但是不清楚是囊胚发育速度还是胚胎发育与子宫内膜容受不同步造成的［8－10］。因此，冻融周期能够保证内膜发育的一致性，能更好地分析囊胚发育速度对妊娠结局的影响。然而在复苏过程中我们会遇到一些比较困惑的问题，如我们是优选D5的囊胚还是D6的囊胚？对于D5的非优质囊胚和D6的优质囊胚，又该如何选择呢？因此本研究的目的是联合囊胚发育速度和囊胚质量分析其对妊娠结局和新生儿出生结局的影响，为SET的囊胚选择提供证据。

资料与方法

一、研究对象

选取2011年7月至2018年6月在北京协和医院生殖中心进行单囊胚冻融移植的患者，对其资料进行回顾性分析。本研究纳入的单囊胚复苏移植的周期数为736个，按照囊胚行成的时间分为两组：第一组为D5组，即在受精第5天行成囊胚；第二组为D6组，即在受精后第6天行成囊胚。再根据各组内囊胚是否为优质胚胎，分为4组，分别为D5优胚组（4～6BB以上者）、D5非优胚组（4～6BC）、D6优胚组（4～6BB以上者）和D6非优胚组（4～6BC）。

二、研究方法

1．囊胚培养及囊胚评分：按照本中心的常规［11］进行操作，在受精后第3天进行移植，移植后的剩余胚胎全部进行囊胚培养。在D5或D6观察是否有囊胚形成，并对囊胚形态进行形态学评分。囊胚评分根据Gardner评分系统［12］进行。根据囊腔的扩张程度分为1～6期，其中4期囊胚为囊腔完全扩张，透明带变薄；5期囊胚为部分滋养细胞孵化至透明带外；6期囊胚为完全脱出透明带。根据内细胞团（ICM）和滋养层细胞（TE）的质量进行分级。ICM分级：A级（细胞数目多，排列紧密）；B级（细胞数目较少，排列松散）；C级（细胞数目很少）。TE分级：A级（细胞数目多，囊腔四周均有细胞排列紧密）；B级（细胞数较少，排列较松）；C级（细胞数目很少）。

根据本中心的既往经验，我们只挑选4期及以上的囊胚进行冷冻保存，达到冷冻标准的胚胎为：ICM质量为A或B级，TE为A、B或C均可。根据本中心操作常规，我们定义ICM和TE质量均在B级以上者（即AA、AB、BA和BB）为优质胚胎，BC级胚胎为非优质胚胎。

2．胚胎冷冻和复苏：本中心全部采用玻璃化冷冻方法进行胚胎冷冻，如文献所述［13］。先用激光进行人工皱缩，待囊腔液全部放出后再进行冷冻，冷冻时先在预平衡液中平衡2min，再转入玻璃化冷冻液中，在30秒内将胚胎放置冷冻载杆（Cryotop，加藤，日本）上，直接浸入液氮保存。囊胚复苏在复苏移植当天上午进行，复苏后的囊胚进行激光辅助孵化，选择在远离ICM的透明带上切割透明带的1／4左右。将复苏后的囊胚移入前一天预平衡好的培养液（G2，Vitrolife，瑞典）中，放入37℃、6%CO2和5%O2的培养箱内培养2h，移植前根据囊胚腔是否重新扩张来判断胚胎的存活情况。

3．子宫内膜准备及胚胎移植：采用人工或自然周期进行子宫内膜准备。移植后采用黄体酮进行黄体支持，移植后8～10d抽血测HCG判断是否妊娠，移植后25～30d进行阴道超声检查，如见胎囊或胎心搏动则判断为临床妊娠。

4．结果判断：临床妊娠率＝临床妊娠总例数／复苏移植周期总例数×100%；活产率＝随访获得活产的总例数／复苏移植周期总例数×100%；流产率＝在妊娠过程中流产的例数／临床妊娠总例数×100%；正常出生体重是指出生体重在2 500～4 000g之间者；低出生体重儿（LBW）是指出生体重＜2 500g者；巨大儿是指出生体重≥4 000g者。

三、统计学分析

采用SPSS 22．0软件进行统计学分析。两组间均数的比较进行t检验，多组间均数的比较采用方差分析，对计量资料进行卡方检验或Fish精确检验。以P＜0．05判断为有统计学意义。

结 果

一、总体情况

共纳入736个复苏周期，复苏后囊腔均有扩张，囊胚存活率100%。患者平均复苏年龄为（35．1±4．4）岁。临床妊娠率为40．9%（301／736），流产率为19．6%（59／301），活产率为26．0%（191／736）。

二、囊胚发育速度对妊娠和出生结局的影响

D5组和D6组间年龄、不育年限，体重指数（BMI）、移植日内膜厚度均无显著差异（P＞0．05）。D5组中移植优质胚胎的比例显著高于D6组（60．4%vs．36．6%，P＜0．05）（表1）。

D5组的临床妊娠率和活产率均高于D6组，且有统计学差异（P＜0．05），两组的流产率无显著差异（P＞0．05）。尽管D5组的男女性别比高于D6组，但无显著差异（P＞0．05）。两组的新生儿出生身长和出生体重均无显著差异（P＞0．05）。D5组巨大儿的发生率略高于D6组，但无显著差异（P＞0．05）（表2）。两组新生儿均未发生出生死亡和先天异常。

表1 D5组与D6组的一般情况比较［（），%］

表1 D5组与D6组的一般情况比较［（），%］

注：与D6组比较，＊P＜0．05

组 别 周期数 年龄 不育年限 BMI（kg／m2） 移植日内膜厚度（mm） 优质胚胎占比D5 301 34．8±4．3 6．0±3．3 21．9±5．3 10．1±1．6 60．4（182／301）＊D6 435 35．0±4．7 5．7±3．7 22．1±4．8 9．9±1．7 36．6（159／435）

表2 D5组与D6组的临床结局和新生儿出生结局［（），%］

表2 D5组与D6组的临床结局和新生儿出生结局［（），%］

注：与D6组比较，＊P＜0．05

组 别 周期数 临床妊娠率 流产率 活产率 性别比（男／女）D5 301 51．5（155／301）＊ 18．7（29／155） 33．9（102／301）＊ 60／42 D6 435 33．6（146／435） 20．5（30／146） 20．6（89／435） 41／48组 别 周期数 出生体重（g） 出生身长（cm） LBW发生率 巨大儿发生率D5 301 3 372．9±570．5 49．5±4．1 5．9（6／102） 12．7（13／102）D6 435 3 309．7±498．8 49．9±1．7 5．6（5／89） 7．9（7／89）

三、囊胚发育速度与形态学评分对妊娠和出生结局的影响

综合囊胚发育速度与形态学评分分组，4组间年龄、不育年限、BMI和移植日内膜厚度均无显著差异（P＞0．05）。D5优胚组的临床妊娠率和活产率最高，D6非优胚组的临床妊娠率和活产率最低。D5优胚组的临床妊娠率和活产率均显著高于其他各组（P＜0．05），D5非优胚组的临床妊娠率和活产率均略低于D6优胚组，但均无显著差异（P＞0．05）；D6非优胚组的临床妊娠率显著低于D5非优胚组（P＜0．05），但两组的活产率无显著差异（P＞0．05）。4组间的出生体重、身长和男女性别比均无显著差异（P＞0．05）（表3）。

表3 各组间一般情况及临床／出生结局比较［（），%］

表3 各组间一般情况及临床／出生结局比较［（），%］

注：与其他各组比较，＊P＜0．05；与D6非优胚组比较，＃P＜0．05

组 别 周期数 年龄 不育年限 BMI（kg／m2）移植日内膜厚度（mm） 临床妊娠率 流产率D5优胚 182 34．9±4．2 6．4±3．6 21．6±5．0 10．0±1．5 60．4（110／182）＊ 17．3（19／110）D6优胚 159 35．6±4．4 6．1±3．9 22．3±4．8 9．8±1．8 45．9（73／159）＃ 17．8（13／73）D5非优胚 119 34．7±4．6 5．5±2．7 22．1±4．9 10．2±1．4 37．8（45／119）＃ 22．2（10／45）D6非优胚 276 35．0±4．6 5．5±3．5 21．9±5．2 10．2±1．6 26．4（73／276） 23．2（17／73）组 别 周期数 活产率 性别比（男／女）巨大儿发生率D5优胚 182 42．3（77／182）＊ 45／32 3 351．9±516．3 50．0±2．3 5．2（4／77） 10．4（8／77）D6优胚 159 27．7（44／159）＃ 22／22 3 333．4±483．8 50．0±1．7 4．5（2／44） 4．5（2／44）D5非优胚 119 21．0（25／119）＃ 15／10 3 437．4±721．0 49．4±2．9 8．0（2／25） 20．0（5／25）D6非优胚 276 16．3（45／276） 19／26 3 286．4±517．4 49．8±2．1 6．7（3／45） 11．1（5／45）出生体重（g）出生身长（cm）LBW发生率

讨 论

如今随着ART的发展，SET已被国内外的各大中心广泛接受，SET成功率有赖于挑选一个高发育潜能的囊胚。本研究的目的是在单囊胚移植周期中探讨囊胚发育速度和囊胚质量对妊娠结局和出生结局的影响，进而探讨如何联合囊胚发育速度与胚胎评分来挑选单囊胚进行移植。

在本研究中，我们发现D5囊胚组的临床妊娠率显著高于 D6囊胚组（51．5%vs．33．6%，P＜0．05），而且D5囊胚组的活产率也显著高于D6囊胚组（33．9%vs．20．6%，P＜0．05），这与 Kaye等［14］的研究结论不一致，他们分析了468个SET周期的资料，发现D5和D6两组囊胚的妊娠率、继续妊娠率和活产率并无统计学差异；而与Ferreux等［15］的研究结论一致，在他们的研究中D5囊胚组的活产率显著高于D6囊胚组，而且根据囊胚的形态学进行分组后，两者的差异仍然存在，认为在质量相似的囊胚中，发育速度快的胚胎的结局优于发育慢的胚胎。分析原因，我们发现本研究中D5囊胚组的优质胚胎的比例显著高于D6组（60．4%vs．36．6%），因此认为这两组的差异可能是样本选择偏倚造成的，这与Ferreux等［15］的研究结论相似，同样他们研究中D5组优质胚胎的比例显著高于D6组（82%vs．68%），作者也认为可能是选样偏倚导致了D5组的结局优于D6组。

为了避免移植胚胎质量偏倚的影响，我们将D5胚胎分为D5优质胚胎组（4～6BB以上级别）和D5非优质胚胎组（4～6BC），将D6胚胎分为D6优质胚胎组（4～6BB以上级别）和D6非优质胚胎组（4～6BC），并进行两两比较。我们发现对于优质胚胎而言，D5优质胚胎组的结局最优，其临床妊娠率和活产率显著高于D6优质胚胎组，也显著高于其他非优质胚胎组，这与Tubbing等［16］的研究结论相似。但是与国内一些研究结论［17－18］不一致，他们认为两组的临床妊娠率和活产率没有统计学差异。在本研究中，对于非优质胚胎而言，D5非优质胚胎组的临床妊娠率显著高于D6非优质胚胎组，但是其活产率并无显著差异，尽管D5非优质胚胎组活产率略高。这与国内研究的结论［17－18］也是不一致的，尽管张怡等［17］发现D5组的临床妊娠率略高，但是未发现显著差异。另外，我们特别对D5非优质胚胎和D6优质胚胎的临床结局进行了分析，结果提示两组的临床妊娠率和活产率相似，尽管D6优质胚胎组略高一些。这与吕兴钰等［18］的研究相似，但略有不同，他们的结果提示两组间无统计学差异，但D5非优质囊胚的临床妊娠率和活产率略高于D6囊胚组，这也可能是移植囊胚数的差异造成的。综上分析，我们与其他研究的差异可能在于对优质囊胚的定义和选择不同，而且我们对囊胚的挑选更加严格，通常ICM评为C时，我们会选择丢弃，而一些中心则会冷冻保存。

也有研究认为两组之间的差异是由于在发育迟缓的囊胚中非整倍体率和基因异常率较高造成的［19－21］。Minasi等［22］对 1 730 个囊胚的整倍体状态和形态学以及形态动力学参数之间的可能相关性进行了研究，他们发现整倍体胚胎开始形成扩张期囊胚的时间更短，而且ICM和TE质量更好，根据患者年龄分组后仍然是D5囊胚组染色体正常的比例更高。因此他们建议在不进行PGS的患者中，选择D5囊胚移植时选中整倍体囊胚的几率更大。与此相反，有研究认为两组的整倍体率无统计学差异，认为非整倍体率与囊胚的发育速度无关［23－24］。最近Irani等［25］发现，在仅移植整倍体胚胎时D5囊胚组的种植率和活产率显著优于D6囊胚，认为囊胚发育速度影响胚胎种植潜能的原因并非整倍体率的差异，可能还存在一些其他的因素，包括胚胎代谢或表观遗传学方面的原因等。由于本研究未进行囊胚整倍体的检测，因此我们尚不能确定D5与D6囊胚移植结局的差异是否是由于染色体异常造成的，还需要进一步研究。

在本研究中，我们还对新生儿出生结局进行了分析，结果发现D5和D6两组患者的新生儿的出生体重、身长和性别比差异不大，尽管D5的男女性别比略高于D6组。两组均未发生先天性畸形和新生儿死亡。当对D5优质胚胎组、D5非优质胚胎组、D6优质胚胎组和D6非优质胚胎组进行两两比较时，均未发现统计学差异，这与郭娜等［10］的研究结论相似，而与Ferreux等［15］的研究结论相反，他们发现D6囊胚组新生儿的出生体重显著高于D5囊胚组，认为这可能是由于D6组孕周较长所致。另外我们发现D5组的男女性别比略高于D6组，这与国内外的一些研究结论［10，15］相似。分析原因可能在于与女性胚胎相比，男性胚胎发育速度更快，能够以更快的速度达到囊胚阶段［26］，而且男性胚胎要比同期的女性胚胎的质量更好［27］。我们在进行囊胚冷冻时，通常会优先选择优质囊胚进行冷冻保存，在复苏移植时也会优先选择优质囊胚进行复苏移植，因此，D5囊胚中男性比例会大一些。在本研究中，我们观察到对于D5和D6的囊胚而言，优质胚胎的男女性别比均略高于非优质胚胎，D6非优质囊胚的男女性别比最低，甚至为女多于男，这与前面的解释相吻合，但具体作用机制还不清楚，有待于进一步研究。

总之，对于尚未开展PGS／PGT的中心来讲，囊胚的形态学评估仍然是SET中囊胚选择的主要手段。本研究提示，在单囊胚的冻融周期中，D5囊胚组的临床妊娠率和活产率均显著高于D6囊胚组，而且D5优胚组的临床结局最好，因此，建议在单囊胚的冻融周期移植时，优先选择D5的优质胚胎；而面临D5非优质胚胎和D6优质胚胎时，两者均可考虑，可以根据实验室的实际情况进行选择。