改善糖尿病内皮祖细胞功能的研究进展

刘景雪，黄 瑾（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药剂科，上海 200437）

糖尿病[1]（diabetes mellitus，DM）是由胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。该疾病导致死亡的主要原因是在长期疾病过程中引发的各种并发症，如：心脑血管病、下肢血管病、高血压等，这些并发症的发生都伴随血管组织的损伤。目前治疗血管损伤性疾病的药物主要是缓解病症、减缓疾病的发展，但在血管损伤修复和血管新生中作用不大[2]。研究表明[3]，内皮祖细胞（endothelial progenitor，EPC）在生理或病理条件下可以从骨髓中动员至外周血，参与损伤血管的修复，并且促进缺血组织损伤后的再内皮化和生长因子释放。EPC的以上特点，为治疗糖尿病所致的血管损伤提供了新的思路和治疗靶点。

1 EPC概述

EPC是一类特殊的干细胞，近年来已经引起学术界的广泛关注。1997年，Asahara 等[4]首次从人的外周血中分离出一种CD34阳性单核细胞，因其能表达血管内皮细胞的标志物，而且具有向血管内皮细胞分化的潜能，故将此单核细胞命名为血管EPC。1999年，Asahara 等[5]证明EPC可来源于骨髓。之后的研究[6]发现，EPC可以出现在脾脏、脐带血等组织。

根据培养特点[7-8]，EPC主要分为早期和晚期两类。早期EPC主要在含血管内皮生长因子（VEGF）的培养基中培养纤连蛋白上的外周血单核细胞产生，类似于成集落内皮细胞（CFU-ECs），培养至2～3周数量达到高峰，形状类似纺锤形，其寿命仅有4周，主要通过提供支持血管生成的多种生长因子来增强血管形成；晚期EPC由单核细胞培养14d以上获得，呈鹅卵石样，可存活12周，这些细胞缺乏造血和骨髓标记物，具有较低的细胞因子释放能力，因增殖能力强，常被称为生长型 EPC。EPC的鉴定方法有很多[4]，包括用特定的生物标记联合克隆形成实验，荧光检测对乙酰化低密度脂蛋白的吸收和与凝集素的结合，以及流式细胞术检测表面标志物。其中，细胞表面标志物[9]包括造血干细胞标记和血管内皮细胞标记物，如：CD31、血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）、血管性血友病因子（vWF）、血管内皮钙粘蛋白（VE-cadherin或CD 144）。

机体在正常的稳态条件下，外周血中存在少量的循环EPC，当机体在缺血、缺氧等情况下，刺激EPC 动员因子，如：VEGF、成纤维细胞生长因子（bFGF）、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）等的释放，这些因子激活一氧化氮合酶（eNOS），导致一氧化氮（NO）产生增加，NO调节基质金属蛋白酶（MMP）的活性，已活化的MMP（如MMP-9）使骨髓中 EPC 释放并动员进入外周循环，在受损部位归巢并分化为内皮细胞，参与内皮受损血管的再内皮化，促进缺血部位的血管新生。因此，EPC 已经成为预测血管疾病的发生、发展及预后情况的重要指标。

2 抑制炎症反应降低EPC损伤

糖尿病患者长期处于高糖环境下，其机体处于一种慢性炎症状态。全身性炎症导致糖尿病患者的新生血管形成和EPC功能受损，可以认为，炎症应激是导致糖尿病进展或恶化的主要原因[10]。研究发现[11]，炎症趋化因子——巨噬细胞炎性蛋白-1β（MIP-1β）在糖尿病患者体内的高表达，可降低EPC的功能，抑制EPC归巢和缺血区的血管新生。

Chang等[12]使用特异性MIP-1β抗体抑制MIP-1β的活性，逆转受损EPC的功能，增强EPC的归巢能力，并增加循环EPC数量，进而促进血管新生。同样具有高度的增殖潜能和分化能力的祖细胞——间充质干细胞[13]（mesenchymal stemcells，MSC），通过改善1型糖尿病（T1DM）的免疫紊乱状态及保护残存的β细胞，进而有效改善血糖状态。周娜等[14]利用间充质细胞可调控巨噬细胞表型的特性，促进其由促炎 M1型向抗炎M2 型极化，从而抑制炎症反应，而且移植MSC可通过募集M2型巨噬细胞使胰岛β细胞增殖和再生，进而影响T1DM的病理生理过程。Yan 等[15]使用肌肽和积雪草酸（AA）组合共同作用于糖尿病小鼠和高糖孵育的人脐静脉内皮细胞（HUVEC），结果显示，该组合降低高糖孵育的HUVEC细胞中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和活性氧（ROS）的产生，提高细胞活力，改善细胞功能；同时，肌肽和AA组合降低糖尿病小鼠体内白细胞介素-6（IL-6）的产生，并限制肾环氧合酶-2（COX-2）活性，小鼠血糖得以控制。冯丽洁等[16]使用二甲双胍与结合运动干预2型糖尿病大鼠，其研究数据显示，二甲双胍和有氧运动均可以降低糖尿病大鼠的空腹血糖，并且可以降低糖尿病大鼠血清TNF-α和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1），TNF-α和VCAM-1浓度的降低减少氧化应激相关分子（如：NADPH氧化酶）的表达，进而减少对EPC的损伤。因此，抑制糖尿病患者的炎症反应，减轻EPC损伤，可有效改善糖尿病患者的自身状态。

3 抑制氧化应激降低EPC损伤

研究显示[17]，氧化应激在血管损伤及动脉粥样硬化形成过程中发挥关键作用。糖尿病血管并发症的病理基础是血管内皮功能受损。前期研究表明[18]，2型糖尿病初期患者已存在血管内皮功能障碍，外周血EPC较健康人减少。在氧化应激状态下，机体氧化酶表达明显增加，促进EPC的凋亡并影响其功能，所以氧化应激是 EPC 数量改变及功能受损的因素之一[19-20]。

李博鹏等[21]观察在胰岛素治疗的基础上再静脉滴注α-硫辛酸对2型糖尿病初诊患者超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）及8-羟基脱氧鸟苷（8-OHDG）含量的影响，同时测定外周循环EPC水平，并分析这些指标间的相互关系。结果显示，应用α-硫辛酸治疗前后，糖尿病患者（30例）EPC 数量差值较对照组（20例）显著增加，SOD、GSH-Px活性的差值较对照组显著增加，MDA、8-OHDG的差值显著下降，表明糖尿病患者通过α-硫辛酸抗氧化治疗，降低其氧化应激水平，使循环 EPC 水平明显升高，进而预防、延缓糖尿病血管并发症的发生。Wang等[22]使用合成的羟基酪醇一氧化氮（HT-NO）研究对糖尿病小鼠和高糖刺激 EPC 的影响，结果显示，HTNO利用其良好的NO释放特性，促进内皮依赖性血管舒张，通过下调沉默信息调节因子1（SIRT1）抑制活性氧（ROS）的产生，降低糖尿病小鼠和高糖刺激的 EPC 氧化应激水平。因此，降低糖尿病患者的氧化应激水平，可以减少对EPC的损伤，进而降低糖尿病患者血管发生并发症的风险。

4 促进EPC的动员

机体处于正常生理状态时，骨髓EPC处于静息状态。在生理或病理因素刺激下，机体释放细胞因子促使骨髓中的EPC大量增殖并向外周血动员。外周血中EPC随着血液循环到达损伤部位，进而被归巢至血管内皮受损部位、分化为成熟内皮细胞进行内皮修复，并参与血管新生。因此，正常的EPC动员功能在维持内皮系统平衡中发挥重要作用。

糖尿病患者外周血中的EPC数量减少，而且功能受损[23]。粒细胞集落刺激因子[24]（G-CSF）在临床上用于化疗期间中性粒细胞减少患者和增加外周血中EPC的数量。单一应用G-CSF很难有效动员骨髓EPC进入外周血循环中。趋化因子受体CXCR4拮抗剂-AMD3100[25-26]可增强EPC的动员，促进心肌梗死后的血管新生。林晓莹等[27]以糖尿病小鼠为研究对象，将AMD3100联合G-CSF用药观察对糖尿病小鼠骨髓EPC的动员。结果显示，AMD3100联合G-CSF动员骨髓EPC的效果优于单一使用AMD3100，而且先使用AMD3100再联合G-CSF的动员效果更佳。郑梦梦等[28]向2型糖尿病合并急性心肌缺血大鼠灌胃瓜蒌薤白半夏汤（GXB），结果显示，GXB组EPC的数量同对照组相比，在第4天达到峰值，然后在一段时间内仍一直维持较高水平，而且GXB组血浆中的VEGF、eNOS、NO的水平均高于对照组，这也验证了骨髓中EPC的动员过程与这些细胞因子有关。目前研究发现，临床降糖药物阿卡波糖和二甲双胍，可以动员骨髓EPC至外周血，增加外周血中EPC的数量，缓解高糖对EPC的功能障碍，这将为糖尿病患者的临床治疗提供安全、精准、有效的动员方案，从而调节机体EPC功能，以促进糖尿病所致的血管疾病的改善。

5 抑制EPC的凋亡

细胞凋亡的过程是一个复杂的级联反应，细胞从接受凋亡信号到调控分子间相互作用，再到蛋白水解酶的活化，整个过程中有许多细胞分子的参与。糖尿病患者由于血糖紊乱，高/低血糖都可以引起脑内线粒体功能障碍，最终导致线粒体凋亡[29]。线粒体具有氧化磷酸化、能量代谢、抗氧化和传递电子等生理作用，线粒体的凋亡是细胞凋亡的主要途径之一。

范艳萍等[30]研究发现，糖尿病阻碍心肌梗死后冠状动脉侧支循环形成并加重心肌细胞的凋亡。血糖升高后对内皮细胞的舒张功能产生影响，使血管通透性增加，CO合成减少，其生物活性降低，进而影响侧支循环形成；血糖升高使机体出现生化异常，糖基化和磷酸化反应增加，糖基化和磷酸化的异常激活转录因子P53，P53在使抗凋亡基因表达减少的同时促使促凋亡基因表达升高，进而加速细胞的凋亡。如果可以减少糖尿病患者的EPC细胞凋亡，那么对于患者预后将有很好的效果。研究发现[31-33]，许多中药成分，如：水飞蓟素、虾青素、红景天苷等呈剂量依赖性抑制糖尿病患者外周血 EPC 的凋亡，促进EPC增殖，进而达到通过抑制EPC的凋亡发挥预防疾病的作用。将上述改善糖尿病患者EPC功能的药物治疗及干预措施简略归纳如下，具体见表1。

表1 改善EPC功能的药物治疗/干预措施

6 结语

糖尿病患者持续高血糖状态，并在各种因素的相互作用下，使得自身EPC功能受损。EPC 功能发生障碍，其内皮修复和血管新生的能力降低，从而导致血管并发症的发生。目前，用于临床降糖的药物有很多，但直接改善糖尿病患者EPC功能的药物鲜有报道。因此，在研究糖尿病患者EPC功能损伤的基础上，寻找更为有效的改善EPC功能的药物和方法，提高 EPC 的存活能力，对于预防或治疗糖尿病并发症有重要的临床意义。