香料烟灰霉病和菌核病病原鉴定及室内药剂筛选

卢灿华 蔺忠龙 甄安忠 马俊红 王岚锋 罗宇卿 盖晓彤 秦西云 夏振远

摘要：为明确保山地区香料烟新发生的“黑秆病”和“白秆病”病原及候选化学防治药剂，本研究依据柯赫氏法则，分离验证病原物致病性，以形态学和分子生物学技术结合鉴定病原物种类，同时运用平板法检测11种杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制效果。结果表明，“黑秆病”，病原为灰葡萄孢菌（Botr-ytis cinerea Pers.r.），命名为香料烟灰霉病，病原菌对509%6多菌灵、70%甲基硫菌灵高度敏感，对55%菌核净锰锌中度敏感，ECs分别为0.03、0.80和6.50mgL：“白秆病”，病原为核盘菌（Sclerotinias clerotiorm（Lib）de Bary，命名为香料烟菌核病，该病原菌对50%6多菌灵、45%王铜-菌核净、709%甲基硫菌灵和55%菌核净-锰锌高度敏感，ECs分别为0.60、1.05、113和1.90mgL。本研究明确了保山地区香料烟2种未知病害的病原物，并获得了敏感性较高的杀菌剂。

关键词：香料烟;真菌病害;灰霉病菌核病病害鉴定

香料烟（Aromatic tobacco）是生产混合型卷烟的重要原料。目前有20多个国家和地区生产香料烟，其中希腊、土耳其和中国是优质香料烟主产国。我国主要香料烟产区有云南保山、新疆、湖北十堰和浙江新昌，常年总产量在100～250t，其中云南保山香料烟总产量占全国年产量的909%以上2列保山香料烟通常在9月中旬开始播种育苗，11月上移栽，移栽50d后开始采收，翌年4月采收结束。采收时按下部叶、中部叶、上部叶自下而上依次分层采摘，每次5～6片叶顶部叶片成熟后一次性砍采。有部分烟农也将砍采后的新生枝作为二茬烟采摘。作为无机盐、水分、营养物质和烟碱的运输器官，茎秆的健康与否与中上部烟叶的产量与质量息息相关。

2018年笔者在保山调查发现部分田块出现为害率达409%以上的未知茎部病害，发病后期病株直立干枯，茎秆变黑或白化，局部着生黑色或白色霉层，当地称之为“黑秆病”或“白秆病”。目前国内香料烟上暂无该类病害的报道。本研究从病害症状、病原学和室内药剂生测等方面开展研究，确定病原菌及候选化防药剂，以期为病害防治提供参考。

1材料与方法

1.1田间调查与病样采集

2018年3月和2019年3月于云南省保山市昌宁县勐统镇、卡斯镇香料烟烟田内对“黑秆病”和白秆病”的症状和发病率进行调查分析，并采集病株茎、叶和花（图1）。

1.2病原分离与鉴定

1.2.1分离纯化病原菌分离与纯化采用组织分离法。用无菌刀片切取0.5cmx0.5cm的病健交界处组织35块;75%酒精表面消毒5s，5%次氯酸钠溶液消毒90s，无菌水漂洗3次;用无菌滤纸吸干组织块，置于PDA培养基表面，25℃恒温培养2～3d挑取菌落边菌丝转接2次，定期观察记录菌落形态，显微观察测量菌丝与孢子的形态、大小。

1.2.2致病性测定病原菌致病性测定采用菌丝块贴接保湿法。在25℃、光暗交替（12h：12h）恒温温室接种病原菌。用牙签在烟株茎部造伤，打孔器（8mm）打取培养5～7d的菌饼，贴接于伤口处，用无菌水润湿的棉花保湿对照烟株接种无菌PDA培养基。记录发病情况，显症后再次分离病原物，并与原分离物进行显微比对。

1.23rDNA-HTS序列测定病原菌基因组DNA采用FungalDNAKit（Omega，No.D3390-02）试剂盒提取。用真菌核糖体内部转录间隔区（internal transcribed spacer，S）通用引物ITS（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）FAITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）扩増病原菌rDNA-ITS序列交由英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。用NCBI数据库BLASTN分析IIS序列相似性。采用MEGA7.0软件程序包中Neighbor-Joining法（bootstrap500）构建系统发育树。

1.3室内毒力测定

1.3.1供试药剂45%王铜-菌核浄可湿性粉剂（江西禾益化工股份有限公司）、50%烯酰吗啉可湿性粉剂（山西奇星农药有限公司）、58%甲霜灵-锰锌可湿性粉剂（西安鼎盛生物化工有限公司）、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂（济源艾格弗作物保护有限公司）、15%三唑酮可湿性粉剂（江苏省盐城利民农化有限公司）、55%菌核-锰锌可湿性粉剂（浙江斯佩斯植保有限公司）、4%春雷霉素可湿性粉剂（吉林省延边春雷生物药业有限公司）、50%福美双-异菌脲可湿性粉剂（江苏快达农化股份有限公司）、50%多菌灵可湿性粉剂（江苏省江阴市农药二厂有限公司）、20%嗯霉-稻瘟灵液剂（河北三农农用化工有限公司）和12.5%腈菌唑可湿性乳剂（安阳全丰生物科技有限公司）。

1.3.2带药培养基制备将杀菌剂用丙酮或无菌水配成有效浓度为1%的母液，置4℃冰箱备用。测定时，用移液器吸取一定量的母液，加入熔化并冷却至55～60℃的培养基，充分摇匀后制板。

1.3.3室内生测方法采用菌丝生长速率法。在预培养56d的供试菌种菌落边缘的同一圓周上，用打孔器打取直径为8mm的菌饼，贴接于带药PDA培养皿中央，以不加药剂处理为对照，每处理重复3次，置于25℃培养箱内暗培养5d。測量各处理的菌落直径，计算药剂对菌落生长的抑制率。将药剂质量浓度转换为对数值x，菌丝生长抑制率转换为几率值y建立不同药剂对病原菌的毒力回归方程，计算各药剂对病原菌的抑制中浓度（Co）

菌丝生长抑制率/%=

2结果

2.1病害调查

黑秆病”该病可见于根茎交界处、茎秆中部、叶及花等部位，以茎秆发病为主。根茎交界处患病时，首先形成水浸状椭圆形至卵圆形的凹陷病斑，边缘红褐色，轮纹明显，长约4.5～16.0cm，后期病斑表面形成灰色霉层（图2A）。茎中部的病斑多见于采收形成的伤口处，中间白色，边缘红褐色，长约05～3.9cm（图2B和C）;发病严重时整株茎变黑。病原菌侵染花器时，花冠变黑腐烂，表面附着大量灰色霉层带有病原菌的花落于叶片可导致叶斑（图2D）。调查发现，在下部叶片采收期，该病在保山市昌宁县勐统镇和卡斯镇的田间发病率为3%～10%。

2.1.2“白秆病”该病多见于根茎交界处，在茎中部、顶端或叶部时有发生（图3）。病原菌由采收形成的口侵入，初期形成水渍状病斑，中间白色，边缘青绿色，病斑表面偶有白色菌丝体附着（图3A和B）。"“白秆病”的病斑长约1.5～30.0cm，比前述“黑秆病”病斑长。后期严重时可整株干枯，摇动茎有响声，剥开后可见黑色椭圆形颗粒物，为5.0～170mmx3～7mm（平均9.1mmx4.5mm，n=50）（图3C、D、E和F）。调查发现该病在勐统镇和卡斯镇的烟田中零星发生，个别田块发病率可达40%以上。

2.2病原分离及致病性测定

黑秆病”组织分离法获得多株菌落形态相似的分离物，取代表性菌株HM-1进行回接和后续试验。病原菌培养5～6d后接种于“云香巴斯玛1号”烟株茎部。接种幼苗时，1d烟株开始萎蔫，5d全部枯死，枯死的组织带有大量灰色霉层接种成株期烟株，3d植株出现明显萎蔫症状，1d病斑处着生大量灰色霉层，烟株枯萎（图4A）。从发病部位经组织分离再次分离获得菌落形态相同的菌株。故确定菌株HM-1为引起香料烟“黑秆病”的病原菌。

2.2.2“白秆病”经病原分离获得多株菌落形态

相似的分离物，取代表性菌株HP-1用于试验。将病原菌接种于烟苗茎部，接种后2d开始萎蔫，5～6d烟苗枯死，烟株茎干枯，常伴有白色菌丝体;接种成株期烟株，5植株开始萎蔫，10d上部叶片枯萎，病斑呈白色（图4B）。从发病部位再次分离获得的菌株菌落形态与初始分离病原菌相同。因此确定菌株HP-1为香料烟“白秆病”的病原菌。

2.3病原菌鉴定

2.3.1“黑秆病”菌病原菌HM-1在PDA培养

基上生长良好，菌落呈扩展型，表面凹凸不平，初期为白色，后期为灰色。气生菌丝发达，呈放射状生长;分生孢子梗簇生，细长型，顶端分枝，未端膨大呈近球形，其上生小梗，着生大量无色单孢孢子，外观呈葡萄穗状;经PDA培养基培养10d，在菌丝体下可形成大量黑色菌核，圆形至长圆形直径2.1～4.6mm（图5A）。初步的形态学鉴定结果显示HM-1与葡萄孢属（Botrytis，）真菌形态相似rDNA-ITS序列同源性分析表明HM-1（MK659869与灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的序列一致性为100%。基于ITS序列构建系统发育树，结果表明HM-1与灰葡萄孢菌聚为一支（图6）。综合形态学特征及IS序列分析结果，可确定菌株IHM-1为灰葡萄孢菌（B.cinerea）。因香料烟“黑秆病”患病茎秆附着大量灰色霉层，加之灰葡萄孢菌常侵染作物引起灰霉病，故将香料烟“黑秆病”命名为香料烟灰霉病。

2.3.2“白秆病”菌菌株HP-1在PDA培养基上

生长良好，菌落为扩展型，表面光滑、平整，初期为白色，后期为灰白色。气生菌丝不发达，呈放射状生长，菌丝无色、透明、有隔膜。病原菌培养7～10d，菌落边形成不定形菌核，菌核表生，初期白色，后期黑色，表面粗糙，大小为2.4～5.0mmx1.43.8mm（平均3.4mmx2.6mm，n=50）将培养物和患病组织表面的菌丝体用透明胶带粘取后显微观察，发现组织较厚，边缘偶有菌丝着生（图5B）。形态学鉴定结果表明HP-1与核盘菌属（Sclerotinia）的真菌形态类似。DNA-TS序列同源性分析表明病菌IHP-1（MK656936）与核盘菌（S.sclerotiorum）的序列一致性为1009%。基于ITS序列构建系统发育树，结果显示HP-1与核盘菌聚为支（图6）。综上所述，菌株HP-1为核盘菌（S sclerotiorum）。因香料烟“白秆病”患病茎秆内部常有大量黑色菌核形成，故将该病命名为香料烟菌核病。

2.4药剂室内生测

2.4.1香料烟灰葡萄孢菌由表1看出，多菌灵、甲基硫菌灵、菌核浄-锰锌对灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制作用最为明显，其抑制中浓度（ECs）分别为0.03、0.80和6.50mgL，说明香料烟灰葡萄孢菌对多菌灵、甲基硫菌灵高度敏感，对菌核净锰锌中度敏感，对其余杀菌剂不敏感（ECs0大于20mgL）。

2.4.2香料烟核盘菌多菌灵、王铜-菌核浄、甲基硫菌灵、菌核净-锰锌等4种杀菌剂的ECs0分别为0.60、105、1.13和1.90mgL，说明香料烟核盘菌对这4种杀菌剂高度敏感，对其余7种杀菌剂不敏感表1）。

3讨论

本研究对云南保山香料烟“黑秆病”和“白秆病”病株进行了组织分离纯化，并依据柯赫氏法则对分离获得的病原物进行致病性检，确定了病原真菌HM-1和HP-1在香料烟上的致病力。根据灰霉病和菌核病病原菌的形态特征1，结合本研究获得的分离物HM-1和HP-1的形态特征、rDNA-ITS序列及系统进化树分析，明确了引起香料烟“黑秆病”和“白秆病”的病原菌分別为核盘菌科内的葡萄孢属灰葡萄孢菌（B.cinerea）和核盘菌属核盘菌（S.sclerotiorum）。目前我国香料烟已报道的病害主要有细菌性斑点病、青枯病、黑胫病、丛顶病、曲叶病、普通花叶病、马铃薯病毒病等1，本研究属国内香料烟灰霉病和菌核病的首次报道。灰葡萄孢菌（B.catered）是第二大病原真菌，其危害仅次于稻瘟病菌1。该病菌寄主广泛，可为害1400多种植物，如番茄、黄瓜、草莓、葡萄、烟草等经济作物。灰葡萄孢菌属死体营养型腐生真菌，从苗期至成株期均可侵染植物，易于侵染双子叶植物成熟和衰老的组织182。灰霉病在烤烟和香料烟的发病部位、发病程度均不相同。烤烟灰霉病已有报道，主要为害成熟期中下部叶片，采收后期偶有茎秆发病2。而香料烟灰霉病主要为害香料烟茎秆，叶部发病较少。香料烟每次采摘56片叶，可形成较多伤口，易被空气中的灰葡萄孢菌附着和侵染，室内接种试验也发现摘除叶片造伤比针刺造伤更易于发病。加之24月份保山地区冷涼、蒸发小、湿度较大，也可加重该地区香料烟灰霉病的发生。

核盘菌（Ssclerotiorum）属死体营养型土传病原菌，可为害600多种植物引起菌核病，其中包括油菜、大豆、花生、向日葵、生菜及番茄等2农作物。冷凉潮湿的环境条件利于菌核病发生2病原菌主要以菌核在田间病残体越冬，成为翌年的初侵染源2。菌核在土壤、病残体中存活时间可长达10年，所以不能通过轮作控制菌核病232。烤烟菌核病在我国北方烟区已有报道，而在云南省烤烟上鲜有发生。保山昌宁地区每年24月气温冷凉、空气湿度大，利于香料烟菌核病的发生。目前，该病在保山香料烟种植田中发生不均。多数田块不发生，部分田块发病率在40%以上，发病较重的田块均为往年重病田。这可能与当地习惯秸秆还田有关。烟农将带有大量菌核的茎秆还田，大大增加了翌年的初侵染菌源量，也为该病的大发生埋下隐患。目前，作物灰霉病的防治主要采用化学药剂。氟啶胺、多菌灵、咪鲜胺等高效低毒的广谱杀菌剂是灰霉病防治的主要药剂252。汪汉成等2研究表氟啶胺和咪鮮胺对烟草灰霉病菌丝生长活性抑制最强，该药剂对烟草灰霉病的保护和治疗作用也較强。周浩等2研究表明多菌灵对烟草灰霉病菌丝生长的抑制活性最强，其次为丙环唑、嘧霉胺和异菌脲，而异菌脲和丙环唑对烟草灰霉病菌孢子发的制活性最强，离体试验也表明异菌脲和多菌灵对灰霉病的防治效果最好。降巧龙等28研究也表明多菌灵、菌核浄对魔芋灰霉病菌具有较强的毒力。本研究表明，多菌灵、菌核-锰锌对香料烟灰霉病菌菌丝生长的抑制活性较强，结果与上述文献结果较为一致;本研究还发现甲基硫菌灵对香料烟灰霉病菌菌丝生长的扣制活性较强，该结果与葡萄灰霉病、黄瓜灰霉病菌对甲基硫菌灵不敏感的结果有差异23，原因可能是不同作物灰霉病菌对甲基硫菌灵的耐药性有差异，此外本研究仅测试了一株病原菌对甲基硫菌灵的敏感性，不同地理来源的香料烟灰霉病菌对甲基硫菌灵的敏感性是否存在差异需进一步研究。

菌核浄、多菌灵是菌核病防治的主要化学药剂。秦虎强等研究表明多菌灵、菌核及甲基托布津均可抑制油菜菌核萌发及杀灭子囊盘。何道根等2研究表明菌核浄对西兰花菌核病的防治效果最好，甲基硫菌灵的防治效果则一般。高崇等评价了11种杀菌剂对烟草菌核病的室内毒力，发现嘧霉胺、多-春-氟菌酰胺、腈菌唑、嘧菌酯、春雷-多菌灵对烟草菌核病菌毒力较强，田间防效试验也证明腈菌唑、春雷-多菌灵的防效达70%以上。本研究表明，香料烟菌核病菌对多菌灵、甲基硫菌灵、菌核净锰锌及王铜-菌核浄均敏感，结果与上述文献较为致。综上所述，多菌灵、甲基硫菌灵、菌核浄-锰锌3种杀菌剂对香料烟灰霉病和菌核病病菌的抑菌活性均较强。因为香料烟“黑秆病”与“白秆病”在田间常混合发生，病害防治时可采用上述3种药剂单施或混合施用。3种药剂在田间条件下的防治效果仍需进一步验证。

本研究虽从11种化学药剂中筛选获得3种候选药剂，但长期使用化学药剂对环境产生副作用、病原菌将产生抗药性。因此，有必要开发新的更低毒、低残留的替代性生物源杀菌剂。近年来，以菌防病、以菌治病的生物防治方法在农作物病害防治方面的应用逐漸多。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、寡雄腐霉（Pythium oligandrun）、深绿木霉（Trichoderma atroviride）、金龟子绿僵菌（Metarhizium Anisopliae）、核盘菌病毒、小盾霉（Coniothyrium minitans）等生防资源在作物灰霉病和菌核病的防控中有较好应用前景3。但是生物防治技术在烟草灰霉病、菌核病防治中的应用较少有必要深入挖掘生防资源，评价其应用潜力。

4结论

经病原菌致病性测定，形态学、分子生物学方法鉴定，将香料烟“黑秆病”病原菌鉴定为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers：Fr），病害命名为香料烟灰霉病;将“白秆病”病原菌鉴定为核盘菌Sclerotinia sclerotiorum（Iib，）de Bary，病害命名为香料烟菌核病。室内毒力测定结果表明，灰葡萄孢菌对多菌灵、甲基硫菌灵、菌核净-锰锌敏感核盘菌对多菌灵、王铜-菌核浄、甲基硫菌灵、菌核锰锌敏感。

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