马齿苋调节人肝癌细胞肺转移裸鼠的血液代谢组学分析

林玩福， 张夏炎， 吕狄亚， 赵沙沙， 曹静文，郁沙莎 ， 程彬彬 ， 翟笑枫 ， 郑国银

1.第二军医大学中医系，上海 杨浦 200433；2.上海长海医院，上海 杨浦 200433；3.海军军医大学，上海 杨浦 200433

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，临床上具有预后凶险、病死率高等特点。目前，肝癌治疗方式众多，以肝切除术为代表的外科治疗仍是肝癌的首选治疗方法，而单一外科手术治疗已到平台期，资料显示2012年至2015年中国肝癌的五年生存率仅为12.1%。以靶向治疗为代表的肝癌药物治疗手段是目前的热点，在晚期肝细胞癌靶向二线治疗研究中，布尼尼布、依维莫司、雷莫卢单抗均针对索拉非尼治疗失败后的肝细胞癌进行了研究，但是它们的中位总生存期（Overall Survival，OS）并没有达标。2017年4月，美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）已经批准瑞戈非尼在治疗后进展的肝细胞癌患者试验，截至2018年1月14日，瑞戈非尼将中位OS改善至10.7个月（95%CI：9.1～12.2），而安慰剂组为7.9个月（95%CI：6.4～9.0），死亡风险减少了38%（HR=0.62；95%CI：0.51～ 0.75；P ＜ 0.0001），从试验中看到的OS延长时间并不是很明显[1]。肝癌的新药研究一直面临困局，中医药作为我国的传统医学，在肝癌的治疗全过程中一直发挥了重要的作用。

马齿苋为马齿苋科马齿苋属植物，广布全球温带和热带地区，喜欢温暖潮湿的环境，在城市和农村地区都能见到，对土壤、湿度、温度、虫害等环境的要求不高，容易栽培存活且适应性极强，其为常用的药食两用植物，也是有名的“救荒本草”。马齿苋地上部分入药，其味酸、性寒，具有清热解毒、凉血消肿之功效。在前期工作基础中，我们发现马齿苋有效成分有多糖、生物碱、总多酚、多不饱和脂肪酸和黄酮等[2-5]，我们对马齿苋提取物的抗肝癌活性成分进行初步筛选，并同时观察到马齿苋提取物在体外有抗肝癌细胞增殖和转移的作用。然而马齿苋的体内抗肝癌效果未知，为探究其体内发挥抗肿瘤作用的有效物质、代谢途径和作用机制，我们通过构建人肝癌细胞肺转移裸鼠模型，来观察马齿苋在体内抗肝癌转移的疗效及其代谢过程[6-9]。

1 实验材料

1.1 实验试剂和仪器

光学显微镜（日本Olympus公司），电子天平（德国Sartorius公司），全自动组织脱水浸蜡机（日本Tepsarvra公司），2035型切片机（德国Leica公司），超净工作台（苏州净化设备仪器厂），二氧化碳孵箱（德国Heraeus公司），ZMN-6803型自动温度控制漂片烤片仪（西安华利电子公司），ZH-3型石蜡切片用冷台（沈阳综纵横高技术公司），IMS图像分析软件（上海申腾信息技术有限公司），TSE型电热保温干燥箱（日本SNAYO公司），脱色摇床（武汉Servicebio），HPLC甲醇（德国Merck公司），乙腈（德国Merck Dannstadt公司），甲酸（美国Sigma-Aldrich公司），L-2-氯-苯丙氨酸（美国Sigma-Aldrich公司），蒸馏水（屈臣氏），低温离心机（美国Thermo fisher FRESCO17公司），其它试剂均为市售分析纯。

1.2 马齿苋制备

马齿苋配方颗粒，购于江阴天江药业有限公司，代号：1203031，依据中国药典2015年标准、江阴天江药业有限公司内校质量标准，取样GZSOP0ZE405中药配方颗粒取样操作流程符合质量规定。按照浓缩颗粒：生药为1∶10的比例温水调制成需要的药物浓度，高浓度2 g/ml、低浓度1 g/ml。

1.3 细胞培养

人肝癌细系Huh 7-luc由海军军医大学附属长海医院中医科实验室传代保存，实验开始前进行复苏。复苏后用含10%FBS的完全培养基，在37℃、体积分数为5%CO2、完全饱和湿度条件下常规培养，培养过程中视细胞的生长状态进行换液，并在细胞达到对数生长期、融合度为80%～90%时进行消化传代或铺板。消化过程中，先将原培养基吸除，用PBS洗涤3次，然后将PBS吸除干净后加入适量含0.25%胰蛋白酶/EDTA进行消化，消化过程放恒温培养箱视消化程度计时12 min，待细胞成接近泥沙样下滑时即为消化完全，取出加入完全培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打均匀后，按照一定比例进行传代，或者计数后进行铺板。

1.4 实验动物

本实验采用的研究动物为BALB/C雄性裸鼠，4周龄，体重约18～20 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证编号为2016-0006。裸鼠饲养于第二军医大学第一附属长海医院中心实验室动物房，SPF级环境，饲料来源于斯莱克公司所用繁殖饲料，通过辐照灭菌，饮用水为高压高温灭菌纯净水，垫料及笼具均由中心实验室动物房提供，高温高压灭菌，所有实验裸鼠均自由采食和饮水[10]。

2 实验方法

2.1 裸鼠肺转移瘤模型建立

选择Huh 7-luc细胞，取处于对数生长期、状态良好的细胞进行常规消化，消化后细胞在离心机离心5 min，后将上清培养基移除，加入PBS重悬细胞，用移液枪轻轻将细胞吹打成单细胞悬液，细胞计数并定量至8×106个/mL，置于冰上备用。取本课题组研制的裸鼠尾静脉注射装置，先将水浴锅预热42℃并保持恒温，固定好裸鼠后将其尾部放入温水中5 min，促使尾静脉扩张，取出后找到两侧扩张明显的静脉，取出胰岛注射用1 mL注射器，吸取200细胞悬液，使针头与尾静脉方向平行，然后进针，有突破悬空感后将细胞注入尾静脉，正确注射进尾静脉应较顺畅无抵触感，退针后用棉球按压针孔止血。

本次造模共24只裸鼠，分为3组，每组8只，分别为对照组、马齿苋高剂量组（10 g/ml）、马齿苋低剂量组（5 g/ml），药物浓度参考本实验先前马齿苋相关实验的结果[7-8]。接种后第7天开始按照分组进行干预，取出配制好的马齿苋溶液，预热至37℃摇匀，取出进行灌胃，每只灌400 μL溶液，对照组灌等体积的无菌生理盐水，加药干预共4周，然后处死取材。眼眶取血，脱臼处死裸鼠，称小鼠体重，剥取肺组织，Bouins液染色24小时后，75%酒精固定，肉眼计数肺转移的结节数目，同时对肺转移病灶进行HE染色、包埋肺组织，制成蜡块，HE染色，镜下复核计算结节数目，观察不同组肺内组织的情况。肉眼所见肺转移的结节呈现半透明样，切开呈实性，染色所见转移灶细胞腺样排列，细胞呈圆形、椭圆形或者不规则形，分化差，核大，深染，核质比大，细胞核分裂相多见。计算转移抑制率=1-（治疗组转移率/对照组转移率）×100%。

2.2 样本前处理

取200 μL血，加入含内标（5 ug/mL，L-2-氯-苯丙氨酸）的溶剂（甲醇∶水=8∶2）0.6 mL，低温离心，12 000 rpm，4℃，离心10 min，取200 uL上清液置进样小瓶，进行代谢组学分析。取等量的各待测样本混合，作为质量控制（Quality Control，QC）样本。

2.3 LC/MS分析

LC-MS分析使用Agilent6538UHDandAccurate-Mass Q-TOF质谱联用仪与Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱。色谱柱选用Waters ACQUITY UPLC@HSS T3（2.5 μm，100 × 2.1 mm）进行分析。

流动相：A-0.1%甲酸溶液，B-乙腈（0.1%甲酸）；流速：0.4 ml/min；柱温：25℃；Post Time：5 min；进样量：3 μL。优化的色谱梯度：0～2 min，5%B；2～13 min，5～95%B；13～15 min，95%B。Post time设为5min，用于平衡系统。

质谱使用正离子模式结合负离子模式，优化后具体的参数如下：capillary voltage，4 kV in positive mode and 3.5 kV in negative mode；drying gas flow，11l/min；gastemperature，3501C；nebulizerpressure，45 psig；fragmentor voltage，120 V；skimmer voltage，60 V。质谱的采集范围m/z 100～1 000。在实验室质谱采集的过程中同时打入参比离子用于监测质量轴的准确性，其中正离子模式参数为：121.050 9，922.009 8；负离子模式参数为：119.036 3，966.000 7。

2.4 统计学分析

使用Agilent Masshunter Qualitative Analysis B.04.00 software（美国安捷伦技术，公司）将原始数据转换成通用的格式mz.data进行分析。在R软件平台下，使用XCMS程序包进行峰的识别，同时保留时间校正，进行自动积分的预处理。同时进行内标归一化以及重量归一化，得到一个包含样品名，m/z-RT对，峰面积的可视化矩阵。将编辑后的数据矩阵导入Simca-P软件（版本11.0），进行中心化和Pareto标度化后，进行多元统计分析处理。采用PLS-DA模型的S-Plot来反映不同组别的离子对组间差异的贡献程度，采用PLS-DA模型的VIP（Variable Importance in the Projection）值，如果VIP＞1则被认为是潜在的差异代谢物。对VIP＞1的值进行独立样本T检验分析，其中P＜0.05的代谢物则被认为是有差异的代谢物。

3 实验结果

3.1 马齿苋对裸鼠肺转移瘤模型的影响

如表1所示，从不同组别的实验性肺转移瘤小鼠肺转移瘤数目上可得，空白对照组转移数为6.86±2.54、低剂量组转移数为4.75±1.91、高剂量组转移数为3.14±1.57，马齿苋高剂量组（G）和马齿苋低剂量组（D）的肺转移数目明显低于正常对照组（P均＜0.05）；且马齿苋高剂量组抑制率为54.16%，马齿苋低剂量组抑制率为30.72%，提示马齿苋能抑制肝癌的肺转移；如图1和表1所示可见马齿苋用药组与空白对照组相比，其肿瘤数目及大小明显下降；而三组的裸鼠体重上差异没有统计学意义。

图1 马齿苋干预后的肝癌肺转移模型裸鼠的肺组织Figure 1 Lung of nude mouse with lung metastasis model of liver cancer after purslane treatment

表1 实验性肺转移瘤小鼠的肺转移情况表Table 1 The number of lung cancer in nude mouse with experimental pulmonary metastasis liver cancer

3.2 血液样品图谱分析

图2为血液样本的离子色谱图，其中A为正离子模式下典型的总离子流图，B为正离子模式下典型的总离子流图。从图中可看出正模式下共得到1342个features，负离子模式下共得到409个features，正负离子出现不同的峰值。

3.3 多元统计分析

我们采用PCA建模方法对QC样本的聚集程度进行考察，如图3示，正（2A）、负（2B）离子模式下QC样本均聚集良好，其离散度明显低于待分析样本的离散度，表明系统稳定性良好。图3示高剂量组、低剂量组和模型组的样本分布分离趋势明显，高剂量组、低剂量组以及空白组的样本分布在不同的区间，提示给药组和对照组之间，以及高、低剂量组之间在代谢产物上存在分离趋势。

从多元统计方法偏最小二乘判别分析（PLSDA）对给药组与模型组样本（如图4示）进行分析。发现正离子（A）、负离子（B）模式下得分图的不同组之间呈现出明显的分离趋势。判别模型质量好坏的主要参数为R2Y（该值代表模型的解释率）及Q2值（该值为模型的预测率）。另外我们还对模型进行排序验证，检验模型是否“过拟合”。模型对于解释两组之间差异及寻找差异物质是可靠的，且从排序验证图得模型不存在“过拟合”现象，即可利用此数据进行后续分析。模型是否存在“过拟合”体现了模型的构建是否准确，未“过拟合”则说明模型能较好地描述样本，并可作为寻找模型生物标记物群的前提；“过拟合”则说明该模型不适用于描述样本，且此数据不宜做后续分析。而本样本的正离子模式下累积R2X=0.7，R2Y=0.921，Q2=0.701；负离子模式累积R2X=0.926，R2Y=0.99，Q2=0.954，说明不同组别的代谢产物的分离明显。同时对模型进行排列测试，如正离子（C）、负离子（D）所示，从检验模型我们可看出模型不存在“过拟合”的现象。

图2 典型总离子流色谱图（TIC）。A为正离子模式下高剂量总离子流图，B为负离子模式下总离子流图Figure 2 The Total Ion Chromatogram of QC（TIC）：（A）ESI+，（B）ESI-

图3 样本及QC样品的PCA得分图Figure 3 The PCA scores plot of all samples：（A）ESI+，（B）ESI-

图4 测试组的PLS-DA模型图得分和排列测试图。A为PLS-DA得分图（pos），B为PLS-DA模型的排列测试图（pos），C为PLS-DA得分图（neg），D为PLS-DA模型的排列测试图（neg）Figure 4 The PLS-DA model score and permutation test chart of all samples：（A、C）ESI+，（B、D）ESI-

3.4 差异物质筛选与鉴定

为了进一步说明马齿苋对肝癌肺转移裸鼠血液的影响，研究采用PLS-DA模型的S-Plot来反映不同组别的离子对组间差异的贡献程度，从图5中可看出，离原点越远的点表明其对组间差异的贡献度越大，其VIP值也越大。其中差异性代谢物的定性方法为：通过搜索在线数据库（Metlin、HMDB等）进行精确分子量的比对，同时通过MS/MS谱图的比对以发现代谢产物名称。如表2所示我们发现人肝癌肺转移裸鼠的差异代谢物有六十余种，其中主要包括有尿素、三甲基乙烯胺、丝氨酸、烟酰胺、肉碱、苯丙氨酸、丙醇、尿酸、色氨酸、乙酰基肉碱、1，2-二苯乙烷-1，2-二醇、丙酰卡尼汀、辛基酰胆碱脱羰基、异丁酰左旋肉碱、棕榈酸、高香草醛硫酸、丙酮、左旋棕榈酰肉碱、左旋肉碱、依莱迪肉碱、4-β-羟甲基-4-α-甲基-5-α-胆固醇-7-烯-3-β-醇、牛磺胆酸盐、2-亚麻酰-甘油-3-磷酸胆碱、2-油酰甘油磷酸胆碱、2-花生四烯酸甘油磷酸胆碱等物质，这类代谢产物覆盖范围较广，其中通路归属主要集中为脂肪酸、氨基酸、能量代谢等相关物质。

图5 马齿苋对肝癌肺转移裸鼠的PLS-DA模型的S-Plot分析。A为正离子、B为负离子Figure 5 The PLS-DA scores plot of all samples：（A、C）ESI+，（B、D）ESI-

表2 马齿苋对肝癌肺转移裸鼠作用的差异表达代谢物列表Table 2 The list of different expression metabolites of nude mouse with lung metastasis model of liver cancer after purslane treatment

（续表2）

4 讨论

肝癌起病隐匿，恶性程度高，手术是最佳的治疗选择，但术后5年生存率仅为30～50%，复发转移率超过60%，现有的药物并不能有效控制手术后的疾病进展，因此探寻有效的诊断标志物和药物干预仍然是目前的研究者需要努力的方向。

代谢组学自问世以来，不断发展更新，目前被广泛应用到临床和基础研究的各个领域中。在肝癌研究中，相比于基因组学与蛋白组学等其他组学技术，代谢组学展现出它独到的优势，代谢组学能反映肝癌体内基因水平、蛋白质水平各因素综合作用下的最终结果，各种微小变化都可能引起代谢物中的差异出现，产生大量异乎寻常的代谢物，因此能够更综合、更准确、更灵敏地反映肝癌肺转移裸鼠的生物体系的状态[11]。

在肝癌代谢组学方面，目前的报道主要集中在肝癌患者领域，比如Yin等[12]利用液质联用技术（LC/MS）对乙肝诱导的肝硬化患者与HCC患者的血清进行代谢组学研究。通过反向液相色谱与亲水作用色谱两种方式获取了25例健康志愿者、24例肝硬化患者与25例HCC患者的血清数据，经过化学计量学标准化和整合的数据用OPLS分析，筛选出了潜在的生物标志物。其中甘氨胆酸，甘氨鹅去氧胆酸，牛磺胆酸以及牛磺鹅去氧胆酸是肝硬化的潜在生物标志物，二氢鞘氨醇与4-羟双氢鞘氨醇是肝癌的潜在标志物。

Gao等[13]利用NMR对肝硬化与HCC患者的血清进行了代谢组学研究。选择了63例健康志愿者、36例肝硬化患者与39例HCC患者，发现与健康人相比，肝硬化与HCC患者的血清中含有更高的醋酸盐、N-乙酰糖类蛋白、丙酮酸、谷氨酰胺、a-酮戊二酸盐、甘油、酪氨酸、1-甲基组氨酸与苯丙氨酸，以及更低的脂蛋白、异亮氨酸、缬氨酸、乙酰乙酸、肌酸、胆碱与不饱和脂类等物质。

对于肝癌动物模型的代谢组学分析目前鲜有报道，本项目采用LC/MS仪器对小鼠血清样本进行检测。对所有样本中这些物质的峰的响应强度数据进行模型判别分析，我们首先使用SIMCA-P了软件对样品进行了PCA分析，随后进行PLSDA、OPLS-DA的模型构建，最终获得了差异性表达代谢物。差异物质种类主要包括氨基酸类、脂肪酸类、有机酸类等。主要影响的通路有氨基酸代谢、脂肪酸代谢、脂质代谢等。

本次实验结果提示马齿苋能够抑制裸鼠肝癌肺转移模型的肿瘤转移，同时对裸鼠的体内代谢产生一定的影响，随着药物浓度的不同，其抑制肿瘤转移和体内代谢产物方面也不同。这一方面说明代谢组学对裸鼠体内代谢物质的检测的灵敏度较高，同时提示马齿苋能够抑制肝癌肺转移的发生，可能在一定程度上与干扰裸鼠的体内代谢有关。在肝癌发生发展过程中，癌组织畸形的能量需求及正常组织功能的受损及紊乱可同时表现于血液中。有研究证实肝癌及癌旁组织间脂酰肉碱的代谢轮廓变化有差异，其中发现相对于癌旁组织，中短链及长链脂酰肉碱在肝癌组织中分别呈现降低及升高的趋势。而本实验通过观察人肝癌肺转移模型血液的代谢产物的差异，初步揭示了肝癌血行转移播散的可能生物学物质基础，提示肝癌的远处播散转移可能与血液内氨基酸代谢、脂肪酸代谢、脂质代谢等小分子物质代谢相关。由于非靶向代谢组学的局限性，本次实验只能初步揭示人肝癌肺转移模式的血液代谢的轮廓，人肝癌肺转移模型的肝脏、尿液等组织等其它体液或组织的代谢如何，是否与血液代谢存在差异，可以通过进一步的检测来逐步揭示。通过对比人肝癌肺转移裸鼠模型的不同组织不同体液的代谢轮廓和产物我们可以更为精确的得出代谢物质，而后通过靶向代谢组学技术精确定位其中差异明显的代谢产物，通过相关代谢途径揭示出肝癌远处转移的分子生物学基础，这有利于阐明肝癌血液转移的内在途径和物质基础。