解脲脲原体DNA检测方法评价及人群感染情况调查

宗曾艳，熊 丹，汤花梅，王萌萌，孔凡虹，阚丽娟，张水兰，张秀明安徽理工大学，安徽 淮南 3000；深圳市罗湖区人民医院检验科，广东 深圳 44030

解脲脲原体（UU）通常在泌尿生殖道内繁殖，与盆腔炎、产后感染、不孕不育、前列腺炎，胎膜早破、早产等疾病密切相关[1-3]，也是非淋菌性尿道炎的致病菌[4]。UU-DNA定量检测，是早期感染诊断，抗病毒疗效观察的重要指标，其检测阳性率高于传统的培养法[5]。实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）是实时检测和定量基因表达，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法[6]，更快速、简便而适用于临床核酸检测。研究表明，PCR技术被认为是诊断支原体、衣原体感染的可靠方法[7]；有研究对常用的3种检测方法进行比较后，也建议对于初筛标本应首选用qRT-PCR检测方法[8]。

目前临床上性能验证主要集中在生化、免疫、临检等领域，分子生物学尚无完整权威的性能验证方案[9]， 2019年 2月 15日 最 新 发 布 的 CNAS-GL039文件由中国合格评定国家认可委员会制定，是对CNAS-CL02:2012《医学实验室质量管理和能力认可准则在分子诊断邻域的应用说明》中有关分子诊断相关检验程序进行性能验证实验所做的具体解释和指导。因此，本研究参考以上文件对qRT-PCR方法检测解脲脲原体核酸的性能进行评价，为检验科分子定量检测方法的性能验证提供参考，并分析2018年全年来我院就诊患者UU感染情况，为UU感染的诊断和治疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 样本与仪器

所需标本为科室收集的临床分泌物拭子标本，储存于-20 ℃。收集2018年1～12月来我院就诊患者检测的UU结果（剔除给药后复查结果），共22 468例。拭子标本均为各科专业人员使用医用棉签在女性宫颈口或男性尿道口1～2 cm处旋转15 s后取出，放置在无菌试管中送检。于上海之江生物有限公司采购的解脲脲原体核酸测定试剂盒，PCR扩增仪SLAN-96S，全自动核酸提取仪Autrax。所有操作步骤和结果判定按照试剂说明书进行。

1.2 方法

1.2.1 精密度评估 各仪器均在在控情况下，取2例UU-DNA阳性宫颈分泌物标本和1例阴性标本。各样本每次5次重复，分4批次测定，各计20次重复，记录每次检测结果，以阴阳性判定，阳性结果以Ct值（达到阈值的最小循环数）作为评判标准，计算不精密度，要求变异度（CV）≤5%，阴性符合率均＞95%则符合要求。

1.2.2 准确度评估 取12例在本实验室用UU-DNA核酸测定试剂盒检测的宫颈分泌物样本（其中阳性样本10例，阴性样本2例），与测序方法进行对比分析，分析结果的一致程度，阴阳性符合率＞95%，则准确度符合要求。

1.2.3 最低检测下限评估 依据上海之江UU核酸试剂盒说明书和《感染性疾病个体化医学分子检测技术指南》，取1例UU-DNA扩增结果Ct值约等于35（浓度约在103copies/mL）样本，进行10次扩增，记录每次检测结果。如为阳性，则记录相应的Ct值，统计10次扩增结果，评判标准参考CLSI-MM17A文件关于检测下限的标准可知，10次扩增结果总阳性率均＞95%则满足要求。

1.2.4 抗干扰能力 （1）抗交叉反应评估：由之江公司提供的包含淋球菌、沙眼衣原体、人型支原体、生殖支原体、白色念珠菌和B组链球菌的质粒（浓度约5×106copies/mL），分别加入到10例UU-DNA阴性标本内，进行扩增，统计10例UU-DNA阴性标本的扩增结果，依据上海之江UU核酸试剂盒说明书和CNAS GL-039标准，要求10例标本结果总阴性符合率≥95%。（2）内源性干扰评估：取1份UU-DNA阳性样本分成4份，各300 μL，每份标本加入正常人红细胞0、6、10、12 μL的样本进行提取，提取DNA后再进行复孔扩增，重复3次，要求均≤5%，并评判符合性。

1.3 UU感染情况调查

对2018年1～12月来我院门诊和住院就诊患者UU-DNA检测结果进行统计分析。纳入本研究中的临床样本数据，已征得本医院伦理委员会的同意和批准。

1.4 统计学方法

采用Excel和SPSS24.0统计分析解脲脲原体阳性率及不同年龄段男性和女性感染情况，分析不同组别间差异使用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 方法评价

2.1.1 结果判定 质控在控情况下，判断检测样本Ct值，结果显示UNDET或＞40，报告为阴性结果；Ct值≤38，报告为阳性；Ct值38～40，则重复测定该样本，如结果仍为38～40，且溶解曲线呈S型，则判断为阳性，否则为阴性。计算最终扩增结果Ct值的均值、标准差及CV，要求CV小于允许总误差5%。

2.1.2 重复性评价 2例阳性标本20次检查结果Ct值分别为25.71±0.14、28.16±0.11，CV值为0.54%、0.39%，均小于允许CV值，阴性标本检测结果均为阴性，符合率100%，验证通过。

2.1.3 准确度验证 选取12例（10例阳性，2例阴性）在本实验室用核酸试剂盒qRT-PCR检测宫颈分泌物样本结果，经DNA扩增后（引物序列为CAATCTGCT CGTGAAGTATTA，ACGACGTCCATAAGCAACT），将产物进行测序，进行结果比对。阳性标本序列经Blast，同源序列100%，为解脲脲原体序列，表明准确度符合本实验室要求。测序结果（图1）。

2.1.4 最低检测下限 测定结果显示，UU标本进行10次扩增，Ct值均小于37，判断为阳性，Ct均值36.26，结果偏倚为1.16%，小于允许CV值5%，检测结果符合要求。

图1 UU-DNA测序实验凝胶电泳结果

2.1.5 抗交叉反应 10例阴性标本加入干扰物质后扩增结果均为阴性，符合率为100%（10/10）＞95%，与混合质粒无交叉反应，结果符合要求。

2.1.6 内源性干扰 加入不同浓度红细胞后扩增样本，检测结果CV值均小于5%，表明不存在明显的内源性干扰，验证结果通过（表1）。

表1 内源性红细胞实验结果

2.2 解脲脲原体感染情况调查

对2018年所有来我院就诊患者经剔除复诊结果后的检测结果进行统计，最后共纳入22 468例标本，年龄11～80岁，男性882例，女性21 586例，总的UU检出13 431例，阳性率为59.8%；其中男性阳性检出率22.7%，女性61.3%，差异有统计学意义（χ2=525.613，P＜0.05，表2）。

表2 UU总感染情况

2.2.1 不同年龄组男性感染情况 本次研究男性882例，检出率22.7%，以31～50岁就诊人数最多，年龄组从小到大感染率分别为25.0%、25.1%、22.1%、14.9%，各年龄组检出率差异无统计学意义（χ2=3.511，P＞0.05），30岁以下组阳性检出率25.0%高于31～80岁组，差异无统计学意义（χ2=1.806，P＞0.05，表3）。

表3 不同年龄组男性UU-DNA检测结果

2.2.2 不同年龄组女性感染情况 本研究女性患者标本21 586例，检出率61.3%，以21～50岁就诊人数最多，阳性率最高年龄组为11～20岁，阳性率69.6%，21～30岁阳性率次之，为63.9%（χ2=2.207，P＜0.05），较年轻组11～30岁阳性检出率64.4%，高于31～80岁组58.0%（χ2=92.830，P＜0.05，表4）。

表4 不同年龄组女性UU-DNA检测结果

3 讨论

实时荧光定量PCR是实验室基因表达分析和食品应用的首选方法，是将传统的RT-PCR方法与荧光共振能量转移现象相结合，利用荧光引物进行PCR，并且具有良好的敏感性和特异性、低污染风险和缩短人工时间等优点，使得实时荧光定量PCR技术成为替代传统PCR的一个有吸引力的PCR方法[10-11]。现在已广泛用于UU-DNA的检测，因此需要充分了解该方法学性能。但多数研究对实时荧光定量PCR方法的性能验证集中于乙肝核酸检测[12-15]，也有部分研究对UU核酸检测进行过性能验证[16-17]。因此本研究对荧光PCR检测UU-DNA进行性能评估。准确度使用测序结果为金标准，12例样本阴阳性结果与测序结果100%吻合，精密度、内源性抗干扰能力CV值均小于5%,最低检出限样本结果Ct值均小于37，结果为阳性，此时平均偏移为1.16%，满足要求，从而保证检测结果的可靠性。

本研究中UU总感染13 431例（59.8%），高于我国其他省份的研究报道[18-20]，与北京地区2013～2016年研究结果相比[21]，本研究男性检出率为22.7%，低于北京地区的31.8%；女性检出率为61.3%，高于北京地区的52.5%，分析可能与不同地区经济发展水平、调查人群、检测方法等因素有关。本研究女性阳性率显著高于男性，与其它研究结果一致[20, 22]，这可能是由于女性特殊生殖系统结构和内分泌激素不同造成的，女性生殖系统的弱酸性环境更适合生殖道病原体存活。本研究中30岁以下女性阳性率64.4%，与30岁以上年龄组具有显著性差异，与部分研究较一致[23]，即阳性率年龄段主要集中在21～30岁，感染率呈现年轻化，与该人群性行为方式，激素水平变化，性知识缺乏等有关。另有研究表明，无症状体检女性中支原体检出率为2.2%[24]，提示应采取措施普及性传播疾病知识，引导本地区女性预防感染，定期体检，适当治疗。男性30岁以下育龄组阳性率为25.0%，高于30～80岁组，目前进行UU检查的育龄男性总体数量偏少，应加强对育龄男性尤其是存在不孕不育疾病的男性进行性疾病知识宣讲，积极进行病原体感染筛查。虽然1988年中国就启动了全国性传播感染监测系统，以监测性传播感染的规模及其趋势，但UU感染率仍呈上升趋势[21]，因此应引起大家的重视，避免忽视或者漏诊，临床科研应进行更多流行病学研究，努力降低UU感染率。

综上所述，qRT-PCR检测方法灵敏度高，重复性好，抗干扰力强，检测下限符合要求，可满足于临床检测；流行病学研究有助于了解深圳地区UU感染情况，从而为临床对UU的干预，防治提供依据。