干细胞转录因子SOX8在口腔鳞状细胞癌中的表达及意义

陈志鹏 李欢 陈树伟 石丁波 宋明

1华南肿瘤学国家重点实验室，肿瘤医学协同创新中心（广州510060）；中山大学肿瘤防治中心2头颈科，3ICU（广州510060）

口腔癌是组织学上来源于口腔黏膜上皮的恶性肿瘤，以鳞状细胞癌最多见，舌为最好发的亚解剖部位。2018年全球口腔恶性肿瘤新发病例35.5万、死亡17.7万例[1]。我国口腔癌发病率约2.2/10万，2015年新发病例4.8万、病死病例2.2万[2]。口腔鳞癌的发病与烟草、酒精、咀嚼槟榔有关，在华南高发地区是不容忽视的卫生经济负担。早期的口腔鳞癌通过手术可以取得满意的根治切除，而存在淋巴结转移、远处转移者需要接受放化疗，远期预后较差。并且在产生对放化疗的抵抗后，口腔鳞癌的疗效还将大打折扣。肿瘤干细胞是影响治疗敏感性的重要原因[3]。在分子生物学水平，识别肿瘤的干细胞特征标志物，仍是目前口腔鳞癌等头颈部肿瘤研究的重点[4]。

SOX（SRY-related HMG-box）转录因子家族在脊椎动物胚胎发育中起重要调控作用[5]。该类转录因子调节异常，则可导致恶性肿瘤发生发展，与肿瘤细胞的干细胞性密切相关[6-9]。目前仍未有关注口腔鳞癌中SOX8表达水平和临床意义的报道。本研究通过免疫组化方法，先行研究SOX8蛋白在口腔鳞癌的表达情况，并分析SOX8表达的临床意义，为进一步探究干细胞转录因子SOX8在口腔鳞癌的具体作用机制提供研究基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料回顾性分析了2007年1月至2013年12月中山大学肿瘤防治中心诊治并经组织病理确诊的口腔癌患者。为进行组织中SOX8蛋白表达检测，入选标准：（1）病理确诊口腔鳞状细胞癌；（2）石蜡标本保存完好，具有足够组织量；（3）初治时不伴远处转移存在、不伴第二原发癌；（4）标本使用通过本单位伦理委员会审批。研究不涉及病例的个人隐私，获准豁免知情同意。研究共纳入68例病例。病例年龄介于34～89岁（中位年龄59岁），男51例、女16例，Ⅰ期11例、Ⅱ期19例、Ⅲ期16例、Ⅳ期21例。

1.2 免疫组化福尔马林固定-石蜡包埋病理组织均保存于中山大学肿瘤防治中心生物标本库。检索调取组织后，采用免疫组化方法检测SOX8蛋白表达情况。组织切片经常规脱蜡、水化——EDTA溶液微波加热修复抗原——3%H2O2阻断内源性过氧化物酶——血清封闭非特异位点、SOX8抗体（1∶50）4℃孵育过夜——二抗孵育——DAB显色——苏木素复染，阴性对照仅使用兔血清。显微镜下对切片拍照并进行SOX8染色强度评分。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计分析。χ2检验用于统计资料两种分类之间表达强度、比率的比较。Kaplan-Meier方法用于生存分析及绘制生存曲线，Log-rank检验用于预后的比较。双侧检验P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SOX8蛋白在口腔鳞癌肿瘤组织、癌旁组织中表达情况癌组织中SOX8染色面积大、着色程度强、主要为细胞质着色，高表达SOX8者占74.6%（50/67）。癌旁组织中仅 15.9%（7/44）高表达SOX8，且仅1例癌旁组织染色为棕褐色（深着色），其余为浅到中等强度着色以及6例无着色（图1）。统计免疫组化结果显示，口腔鳞癌中SOX8表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.001，表1）。

图1 口腔鳞癌组织、癌旁组织中SOX8的表达（×10，放大部分×200）Fig.1 The expression of SOX8 in oral squamous cell carcinoma tissues and corresponding adjacent normal tongue tissues by immunohistochemistry analysis（×10，magnifiedarea×200）

2.2 SOX8表达的临床病理意义结合病例信息，分析口腔鳞癌中SOX8表达水平与临床病理特征的关系。口腔鳞癌中SOX8的表达水平与肿瘤原发灶大小、鳞癌分化程度以及复发有关。T3～T4期肿瘤直径更大、侵袭更广泛，SOX8的表达水平更高（P=0.017）。鳞癌的分化程度越低，恶性度越高，SOX8表达水平越高（P=0.019）。SOX8表达与口腔鳞癌是否复发有关，本研究中存在31例局部或远位复发病例，其中87.1%高表达SOX8，与低表达者相比差异具有统计学意义（P=0.03）。在口腔鳞癌高危因素中，吸烟、饮酒的患者SOX8高表达的比例均较高，但差异无统计学意义（P=0.050，P=0.078）。而SOX8的表达水平与患者性别、年龄、淋巴结N分期、是否有咀嚼槟榔史无相关性。

表1 口腔鳞癌组织、癌旁组织中SOX8的表达Tab.1 The statistics of SOX8 expression in oral squamous cell carcinoma tissues and corresponding adjacent normal tongue tissues 例

表2 SOX8的表达与口腔鳞癌临床病理因素的相关性Tab.2 Association of SOX8 expression and patient′s clinicopathological features in OSCC.case（percentage）例（%）

2.3 SOX8高表达的口腔鳞癌患者预后不良Kaplan-Meier法分析患者总生存率，生存曲线显示SOX高表达患者较低表达患者预后差，Log-rank检验差异具有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图2 SOX8不同表达的患者生存曲线Fig.2 Kaplan-Meier analysis of overall survival of OSCC patients with different SOX8 expression（P＜ 0.05，Log-rank test）

3 讨论

口腔鳞癌在华南地区发病率较高，临床上采取外科手术为主的综合治疗。目前新的治疗手段如免疫检查点抑制剂在大多数头颈部鳞癌中的应用非常有限[10]。晚期病例仍以放化疗为主，肿瘤一旦进展或复发，对治疗产生抵抗后更难以取得满意疗效。肿瘤干细胞是影响治疗敏感性的重要原因[3]。部分口腔鳞癌也会发展出对化疗药物顺铂的抵抗[11]，进而转移或复发，影响患者生存。因此研究口腔鳞癌恶性进展及复发的标志物，具有临床意义。

笔者在口腔鳞癌及癌旁组织中通过免疫组化检测了SOX8的表达。口腔鳞癌组织上SOX8高表达，且主要表达于细胞质。SOX8弱表达的癌旁组织中，染色部位多位于细胞核与细胞质。SOX8表达越高，组织学分化程度越低，侵袭越广泛（T3-T4期），总体而言SOX8高表达的口腔鳞癌恶性程度高。并且SOX8高表达患者临床复发率高，且总生存率低，SOX8与患者的不良预后存在相关性。

在肺癌[12]、乳腺癌[13-14]等肿瘤中，均有报道SOX家族作为肿瘤干细胞转录因子与其他转录因子、microRNAs之间形成通路，调控肿瘤干细胞性的研究[5]。最早SOX家族研究聚焦在脊椎动物胚胎发育、干细胞诱导等领域[15]。其后也有报道SOX2调控舌鳞癌的干性，与患者不良预后有关，可被MTA3负调控[16]。而SOX-E亚家族（SOX8/SOX9/SOX10）中研究较早的SOX9和Slug可以共同维持乳腺癌的肿瘤干细胞状态[7]；敲除SOX9基因后，化疗抵抗的肿瘤细胞生长被抑制，肿瘤干性标志物ALDH1A3和Wnt信号通路转导活性降低[17-18]。LARSIMONT等在乳腺癌中通过ChIP-seq发现SOX9直接与TCF4和LRP6启动子结合，增强肿瘤细胞的干性，促进肿瘤的发生[18]。可见SOX9调控干性的机制研究开展已比较深入，包括头颈鳞癌中：miR145通过旁分泌靶向抑制SOX9/ADAM17轴，下调头颈鳞癌肿瘤干性[8]，SOX9高表达的喉鳞癌相应的细胞周期S期比例更高[20]。而同源基因SOX8的研究关注较少，最近TANG等[9]在三阴乳腺癌中发现转录因子ZEB1-SOX8信号轴参与维持三阴乳腺癌的肿瘤干性。目前仍未有关注口腔鳞癌中SOX8表达水平和临床意义的报道。

调控基因的转录因子等元件位于细胞核基因上，本研究的免疫组化结果显示SOX8在弱表达的癌旁正常组织中多位于细胞核与细胞质，而在口腔鳞癌组织上SOX8主要表达于细胞质。SOX8在细胞内的亚定位可能提示SOX8蛋白与细胞质其他因子之间存在相互关系。SOX8与临床病理特征的相关性，也佐证了其促进肿瘤的恶性表现。与低表达SOX8的口腔鳞癌相比，高表达SOX8者：总生存率预后较差，原发肿瘤直径大、侵袭更广泛（T3-T4期），分化程度低，临床复发率高。而SOX8表达高低与淋巴结转移、TNM总分期无关，可能其更倾向于影响癌细胞的侵袭性，而非转移性。限于本研究纳入病例数量，未能分析远处转移与SOX8的相关性。同时，口腔鳞癌患者性别、年龄、烟酒槟榔等高危因素也与SOX8的表达水平无关。

综上所述，口腔鳞癌中干细胞转录因子SOX8高表达，可视为口腔鳞癌预后不良的标志，并与肿瘤T分期高（T3～T4）、病理分化程度低、复发率高等临床病理特征有关。SOX8高表达的口腔鳞癌患者总生存率预后差。