低温及其信息素蛔甙对松材线虫睡眠的影响

杨永昌， 赵美萍， 谢武韬， 高玲玲， 郭艳琼， 赵莉蔺*

1山西农业大学农学院，山西 太谷030801； 2中国科学院动物研究所，农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室，北京100101； 3山西大学附属中学，山西 太原030006；4澳大利亚联邦科学与工业研究组织农业与食品科学部，澳大利亚 珀斯6913

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus（Steiner &Buhrer） Nickle 是世界农林重大害虫之一，是松树萎焉病（pine wilt disease， PWD）的主要致病因子（Mamiya，1983）。 松材线虫传播到欧亚国家后便迅速蔓延，大面积危害松林（Wingfield et al.，1982，1984），现已成为40 多个国家的植物检疫对象（Dwinell，1997； Rautapaa，1986； Smith，1985）。

目前，对睡眠机制的研究主要集中于秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans（Raizen et al.，2008）。 相关研究发现，秀丽隐杆线虫的静息行为符合判断睡眠的标准：拥有静息行为、觉醒阈值增高、特定的姿势、睡眠剥夺促进入睡、由分子时钟调控的片段化睡眠等（Nelson & Raizen，2013）。 秀丽隐杆线虫的静息行为分为两类：发育阶段睡眠（developmental sleep， DTS）和压力诱导睡眠（stress-induced sleep，SIS）（Trojanowski & Raizen，2016）。 其中，引起细胞应激的环境因素也可以促进SIS，包括热应激、感染、饥饿、毒性物质等（Los et al.，2013； Jones &Candido，1999； Raizen et al.，2008； You et al.，2008），其睡眠历期也取决于环境因素作用的强度（Hill et al.，2014）。 秀丽隐杆线虫在应对环境应激压力时，除采取dauer 滞育转型措施外，SIS 对线虫适应应激压力也很重要（Fry et al.，2016）。 类似的，松材线虫遇到长期的干燥、低温、食物缺乏、种群密度增大等不利环境条件时，会形成LⅢ滞育虫态（赵莉蔺，2007），在突然施加的短期环境压力下，可以观察到松材线虫采取了另一种“假死”策略，而此现象研究甚少。

蛔甙（ascarosides）是一类重要的信息素（Von et al.，2012），可诱导dauer 形成并影响线虫聚集、交配等其他复杂行为。 研究发现，秀丽隐杆线虫处于饥饿和繁殖交配期等不同状态时分泌的蛔甙的种类、浓度和不同种类蛔甙比例有很大区别（Kaplan et al.，2011； Park et al.，2012）。 Butcher et al.（2007）研究发现，秀丽隐杆线虫在不同温度下分泌蛔甙的浓度不同并可诱导不同的行为反应。 蛔甙在秀丽隐杆线虫中研究较多。

葡萄糖、海藻糖、山梨糖醇和甘油等小分子抗冻物质常被线虫用来作为抗寒保护剂，其中海藻糖是最重要的一类（Ash et al.，1986； Grewal et al.，2002）。 然而，迄今为止，有关蛔甙在松材线虫中的功能作用仅有与松墨天牛Monochamus alternatusHope 互作的少量报道（Zhao et al.，2014， 2016）。温度作为生态环境的重要组成因子，深刻影响松材线虫的生态分布，其世代时间随着适温区温度的下降而延长（Zhao et al.，2007）。 线虫采取耐冻型和避冻型2 种耐寒策略应对低温胁迫作用，如马铃薯腐烂线虫Ditylenchus destructor以幼虫形式在土壤中越冬（林茂松，1999）、海藻糖等低分子量抗冻保护物质在线虫体内聚集（Ash et al.，1986； Grewal et al.，2002）。 本研究探讨了低温环境应激压力下，松材线虫的静息行为、糖醇含量变化和线虫蛔甙分泌种类及含量的变化，研究了不同种类、浓度的蛔甙对松材线虫静息行为的作用，以期为进一步阐明松材线虫种内互作的化学与分子机制提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 供试松材线虫来源与培养方法

供试松材线虫均取自浙江省富阳市的疫木，通过贝尔曼漏斗法（Baermann，1917）分离线虫，并在中国科学院动物研究所农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室使用常规马铃薯葡萄糖（potato dextrose agar，PDA）培养基接种灰葡萄孢菌Botrytis cinerea 并进一步扩大培养。

同步化繁殖型线虫样品制备：待灰葡萄孢菌长满90 mm PDA 培养基时，接入混合龄松材线虫，置于25 ℃黑暗条件培养4～5 d。 采用15 mL 磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffered solution，PBST）冲洗PDA 培养基2～3 遍，制得混合龄松材线虫悬液，并收集于90 mm 玻璃培养皿内静置4 ～6 h。 待松材线虫虫卵粘附在培养皿上，将含松材线虫的悬浮液丢弃，并用PBST 缓冲液温和冲洗2 ～3 次，取适量PBST 缓冲液于培养皿内，以水位不超过3 mm 为宜。 24 h 后，3000 r·min-1离心2 min 即得到同步化2 龄幼虫（L2）。 分别将同步化L2幼虫置于灰葡萄孢PDA 培养基培养1、2、3 d，采用贝尔曼漏斗法收集并离心即得到同步化3 龄幼虫（L3）、4 龄幼虫（L4）和成虫。

1.2 线虫分泌粗提物的制备

使用50 mL 锥形瓶大麦培养基接种灰葡萄孢菌，待菌生长17 d 后，接种松材线虫悬液200 μL，25 ℃人工气候箱培养8 ～10 d，此时大量线虫转移到锥形瓶壁上。 用30 mL 蒸馏水将线虫冲出后，将洗脱液收集到15 mL 离心管中， 室温13300 r·min-1离心15 min，收集上清液于新15 mL 离心管中，用旋转蒸发仪浓缩至蒸干，加入1 mL 乙醇重溶，室温13300 r·min-1离心15 min，收集上清液于0.22 μm 针式过滤器（millipore）过滤后，-80 ℃保存备用。

1.3 低温胁迫处理

PBST 缓冲液清洗同步化L2、L3、L4和成虫3～4遍后，分别取各龄期线虫100 头置于含3 mL PBST缓冲液的培养皿中（直径35 mm），并放到4 ℃人工气候箱中，作为处理组；取相同处理的各龄期线虫放到25 ℃人工气候箱中，作为对照组。 每组10 次重复。 处理48 h 后置于体视显微镜下观察计数，DP72 摄像拍照记录。

1.4 松材线虫糖及多元醇含量测定

样品制备：采用蔗糖悬浮法将接种灰葡萄孢菌的PDA 培养基中冲出的松材线虫与其他杂质分离后（Freckman et al.，1975），混匀，分为3 份，其中1份用旋转蒸发仪蒸干后称线虫干重，其余2 份分别作为低温胁迫处理和对照，每组设置5 个重复。 处理48 h 后，3000 r·min-1离心1 min 收集线虫于2 mL 离心管中，自动研磨仪破碎90 s，加入色谱纯甲醇700 μL 后， 充 分 震 荡30 s， 加 入80 μL 2 mg·mL-1核糖醇内标后充分震荡60 s，70 ℃水浴20 min 后，11000 r·min-1离心15 min；取上清150 μL 置于1.5 mL 离心管中，旋转蒸发仪蒸干，加入40 μL methoxyamination reagent （20 mg·mL-1，Sigma-Aldrich），37 ℃、120 r·min-1摇床震荡3 h，再加入70 μL 三氟乙酰胺，37 ℃、120 r·min-1摇床震荡1.5 h，待样品充分衍生化后，加入300 μL ddH2O， 500 μL 色谱纯异辛烷，充分震荡后离心，取上清液用无水硫酸钠过滤后置于样品瓶中，-80℃保存备用。

上机检测：使用气相色谱质谱（GC： Aglient 6890N， MSD： 5973）进行定性定量。 具体色谱条件：载气为氦气，流速设置为1 mL·min-1；色谱柱（型号HP-5，60 m×0.25 mm，0.25 μm）自动进样，进样量1 μL，无分流进样，进样口温度230 ℃。 升温程序为：70 ℃保持5 min，5 ℃·min-1升温至310℃，保持12 min，快速降温至70 ℃后保持5 min。

1.5 松材线虫蛔甙含量测定

样品制备：与1.4 中类似，采用蔗糖悬浮法清洗线虫后，混匀，分为3 份，其中1 份用旋转蒸发仪蒸干后称线虫干重，其余2 份分别作为低温胁迫处理和对照（以ddH2O 替代PBST 缓冲液）。 处理48 h后，3000 r·min-1离心2 min，收集上清液于1.5 mL离心管中，弃线虫，旋转蒸发仪蒸干后，加入700 μL色谱纯乙醇重溶，-80 ℃保存备用。

上机检测：样品先经ZORBAX_SB-Aq 液相色谱柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）分离后，进入LTQ Orbitrap 系统分析。 样品在色谱柱上的洗脱梯度是8%～100%甲醇（另一相为2%甲醇、0.1%甲酸）洗脱15 min，洗脱速度为250 μL·min-1。 质谱参数：一级质谱Orbitrap 扫描范围是90 ～400 m·z-1，一级质谱里选取141、155、153、169、197、195 m·z-1进行二级质谱LTQ-CID 碰撞模式，标准化碰撞能量50%，活化q 值0.25，活化时间10 ms。

1.6 生物测定

在25 ℃条件下，以700 μL 1% 琼脂（agar）为载体，将粗提物、蛔甙C5、C6、ΔC6、C7、C9 和ΔC9涂抹于agar 载体表面，超净台吹干后加入约50 头松材线虫成虫，同时以蒸馏水涂抹1% agar 作对照。蛔甙C5、C6、ΔC6、C7、C9 和ΔC9 浓度分别为100、10、1 nmol·L-1，10 pmol·L-1、10 fmol·L-1和10 amol·L-1。 每组设3 个重复。 蛔甙处理18 h 后置于体视显微镜下计数，并用DP72 拍照记录。

1.7 数据处理

数据采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，采用Turkey 多重比较法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 低温对松材线虫静息率的影响

通过对低温条件下不同龄期的松材线虫的静息率比较，结果显示，与25 ℃对照相比，4 ℃条件下，L2、L3、L4和成虫的静息率大幅提升，具体表现为活动减少、进食停止、形态上呈C 型、对刺激的反应降低等。 其中，L3对低温最为敏感，低温处理后的静息率最高，达到73.70%，而L2和成虫对低温的敏感度较L3低，分别为53.43%和55.80%；但是，成虫在25 ℃条件下几乎不表现出静息状态，因此与对照组相比，成虫的静息表型差异最大，为对照的30.09 倍，而L2、L3、L4在常温条件下仍有少量静息虫态，所以与对照差异较小，分别为对照的5.29、5.67、8.73 倍（图1）。

2.2 低温对松材线虫体内糖、醇含量的影响

如图2 所示，低温胁迫处理能诱导松材线虫中海藻糖合成，其海藻糖含量显著高于25 ℃常温处理组，约为对照的2.32 倍；而山梨糖醇、葡萄糖和甘油含量与对照均无明显差异。

图1 低温对松材线虫静息率的影响Fig.1 Effects of low temperature on fraction quiescence of pinewood nematode

图2 低温对松材线虫糖、醇含量的影响Fig.2 Effects of low temperature on free sugars and polyols of pinewood nematode

2.3 低温对松材线虫蛔甙分泌的影响

通过测定6 种蛔甙（C5、C6、ΔC6、C7、C9 和ΔC9）在常温下（25 ℃）的分泌模式及在4 ℃低温条件下分泌量的变化。 结果显示，C5、C6、ΔC6、C7、C9 和ΔC9 中，C5 含量最高，浓度达到371.14 nmol·L-1·mg-1，C6、 C7 和ΔC6 含 量 次 之， 为77.21、16.45、8.10 nmol·L-1·mg-1，ΔC9 分泌的最少，仅为0.31 nmol·L-1·mg-1，C9 常温下几乎不分泌；低温条件下，除C9 外，其余蛔甙的含量均大幅下降，其中，C5 和C6 分别为对照的4.36% 和15.30%。 值得注意的是，ΔC6、C7 和ΔC9 在低温胁迫条件下停止分泌或者分泌含量低于仪器检测限，几乎检测不到；而C9 在低温下开始分泌，可能与松材线虫在低温条件下的滞育有关（图3）。

2.4 粗提物对松材线虫静息率的影响

如图4 所示，粗提物处理后，松材线虫的静息率在6～9 h 内较对照迅速升高，在9 h 时静息率最高，约为100%；之后在9 ～12 h 中静息率维持在100%左右；约3 h 之后，静息率逐渐下降，在27 h时，达到最低值，仅为1.10%。 为了探究粗提物对从静息状态恢复的线虫的影响，我们取27 h 时一部分的恢复线虫再次进行粗提物处理，结果显示，其静息率在1 h 内提升到最大值，但仅为初次粗提物处理的一半，达到了50.15%。 之后，进入稳定时期，松材线虫静息率随时间变化比较稳定。 本实验也做了未加松材线虫的灰葡萄孢菌大麦培养基的粗提物对松材线虫静息率的影响，结果显示，其静息率维持在一个极低的水平。

图3 低温对松材线虫蛔甙含量的影响Fig.3 Effects of low temperature on ascarosides of pinewood nematode

图4 粗提物对静息率的影响Fig.4 Effects of crude extracts on fraction quiescence of pinewood nematode

2.5 蛔甙对松材线虫静息率的影响

蛔甙静息率曲线（图5）表明：松材线虫对不同浓度的蛔甙静息表现不同。 结果显示，线虫对C6、C9 和ΔC9 的感受随着浓度变化具有基本相同的模式，随着蛔甙浓度降低，松材线虫的静息率呈现先上升后下降的趋势：在10 nmol·L-1浓度时静息率达到最高点，其中，C6 和C9 效果较明显，静息率为47.36%和49.93%。 而C7 则呈现为另一种模式，随着C7 浓度降低，松材线虫静息率持续升高：在10 fmol·L-1浓度时达到最大值61.08%。

图5 蛔甙对松材线虫静息率的影响Fig.5 Effects of ascarosides on fraction quiescence of pinewood nematode

3 讨论与结论

本研究表明，L2、L3和L4在常温条件下存在一定数量的静息虫态，这可能与一些线虫正处于龄期末的脱皮阶段（Raizen et al.，2008）即DTS 静息状态有关，使松材线虫幼虫的静息率存在一定的本底水平，与此相对地，成虫在25 ℃时几乎不存在静息虫态。 研究表明，低温胁迫作为一类应激条件可以诱导较多数量松材线虫进入SIS 静息状态；而糖醇测定结果则表明，松材线虫通过增加海藻糖等抗冻物质合成的策略来降低过冷却点，增强其耐寒性。

此外，本研究表明，松材线虫分泌粗提物中存在诱导线虫进入静息状态的信息物质。 低温处理后，松材线虫开始分泌C9，表明C9 可能在诱导松材线虫进入静息状态或在低温条件下诱导其他蛔甙含量变化起着关键作用；其他5 种蛔甙（C5、C6、ΔC6、C7和ΔC9）的含量均大幅下调，其中C7 和ΔC9 停止分泌，可能在诱导静息信号传导中起重要作用。 而蛔甙静息实验证明，C6、C7、C9 和ΔC9 为静息诱导信号分子，松材线虫对C5、C6、C9 和ΔC9 的感受具有基本相同的模式，在较高浓度作用较为明显； C7 在高浓度时诱导作用也较明显，但是在较低浓度时与之相反，松材线虫静息率反而有增高的趋势。 值得注意的是，任意单一一种蛔甙都无法解释低温下蛔甙种类及浓度变化对SIS 的诱导现象，由此可见，可能C5、C6、C7 和C9 与C7 共同参与了对松材线虫耐寒性的调控，C7 与其他种类蛔甙在静息调控方面是一种拮抗关系，而C7 在其中起主导作用，在低温胁迫作用后，C5、C6、C7 和C9 含量大幅下调，解除了对C7 的抑制作用。 结果C7 浓度虽然同样下降，但其他蛔甙的抑制解除反而使松材线虫进入SIS，表现出对低温的适应。 因此，有待进一步阐明蛔甙对松材线虫压力诱导睡眠行为的作用，并揭示其内在分子机制。