乳酸菌对红曲黄酒酿造过程酵母菌生长及风味物质形成的影响

洪家丽 陈 敏 周文斌 郭伟灵 李 路 黄梓芮 刘 斌 白卫东 倪 莉 饶平凡 吕旭聪，3*

（1 福建农林大学食品科学学院 福州 350002

2 福州大学食品科学技术研究所 福州 350108

3 福建农林大学国家菌草工程技术研究中心 福州 350002

4 仲恺农业工程学院轻工食品学院 广州 510225）

黄酒是我国的传统发酵酒，具有几千年的历史和独特的工艺，与啤酒、葡萄酒并被誉为“中华国粹”[1]。红曲黄酒因添加了红曲进行发酵而具有与众不同的功效[2]。酵母菌是酿酒过程中最重要的微生物之一，酵母菌主要通过对糖分解、转化或同化淀粉和糊精，产生乙醇，同时代谢产酸和脂类物质，其数量变化对黄酒品质有很大影响[3-4]。红曲黄酒香气成分复杂，主要产生于发酵过程中，由于霉菌和酵母菌等微生物代谢的产物或微生物之间相互作用，产生挥发性香气成分[5-6]。这些成分在黄酒中所占比例极微，然而对风味有较大影响[7]。黄酒传统酿造除了霉菌和酵母菌外，还有大量细菌参与，如：麦曲黄酒具有特殊的曲香，酒中氨基酸含量较高，这与麦曲中细菌菌群分泌的酶及其代谢产物有密切联系[8]。细菌对酒中挥发性风味物质形成的影响主要通过两个途径：一是细菌自身产酯酶，通过酯酶的催化作用影响挥发性代谢产物的生成[9]；二是细菌通过与酵母菌间的相互作用影响其发酵代谢活性[10]。乳酸菌在黄酒酿造过程中除产生乳酸外，还以乳酸为底物产生乙酸、琥珀酸等其它有机酸，而这些有机酸通过酯化反应生成相应的乙酯类化合物，这些乙酯类化合物恰恰是黄酒中重要的香气物质[11]。目前，对于黄酒中霉菌和酵母菌的基础研究和应用研究较多[12-13]，而对于乳酸菌对红曲黄酒酿造过程中酵母菌生长及风味物质形成的影响鲜有报道。

课题组前期从酒曲和传统酿造过程中分离鉴定出6种乳酸菌。本文主要考察了不同乳酸菌对红曲黄酒酿造过程中酵母菌生长及风味物质形成的影响。采用纯种多菌混合发酵方法，构建微生物共培养酿造体系，应用荧光定量PCR（qPCR）技术跟踪发酵过程中酵母菌的动态变化，利用高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）等技术测定发酵过程中各种理化指标和风味物质的变化，进一步深入研究不同乳酸菌对红曲黄酒酿造过程中风味物质形成的贡献，从而推测发酵过程中的微生物与风味物质变化的内在联系，筛选出潜在可应用于酿造红曲黄酒的优良乳酸菌菌株。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

所用微生物菌株均为课题组前期从红曲黄酒传统酿造用曲和酿造过程中分离纯化鉴定获得。乳酸菌菌株包括巴氏葡萄球菌（Sp）、肠膜明串珠菌（Lm）、戊糖片球菌（Pp）、乳酸乳球菌（Ll）、植物乳杆菌（Lp）和干酪乳杆菌（Lc）；真菌菌株包括紫色红曲霉（Mp）、米根霉（Ro）和酿酒酵母（Sc）。

1.2 仪器与设备

ABI Step One Plus型RT-qPCR仪，美国应用生物系统公司；D-2000日立LaChorm Elite高效液相色谱仪，日立高新技术公司；HP GC6890N-MSD5975气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司；PB-10 pH计，德国赛多利斯公司；HP GC6890N-MSD5975型气相色谱质谱联用仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基 MRS肉汤培养基：将6株乳酸菌接种于灭菌过的MRS肉汤培养基；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：将红曲霉和米根霉接种于灭菌过的PDA培养基；酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基：将酿酒酵母接种于灭菌过的YPD培养基。

1.3.2 纯种多菌混合酿造工艺

图1 纯种多菌混合酿造工艺流程图Fig.1 Process flow diagram of mixed-cultures fermentation

1.3.3 乳酸菌强化发酵体系的构建 以红曲霉（106个/g 糯米）+米根霉（106个/g 糯米）+酿酒酵母（106个/g糯米）为基础发酵体系，在此基础上分别接种不同乳酸菌（104个/g糯米）进行强化发酵，以不添加任何乳酸菌为空白对照，共7个体系，分别是巴氏葡萄球菌（Sp）体系、戊糖片球菌（Pp）体系、肠膜明串珠菌（Lm）体系、乳酸乳球菌（Ll）体系、植物乳杆菌（Lp）体系、干酪乳杆菌（Lc）体系及空白（C）体系。

1.3.4 酵母菌基因组DNA提取和纯化 酵母菌基因组DNA的提取采用氯化苄法[14]，提取后的DNA溶液经过磁珠法[15]纯化后，于-20℃冰箱保存。

1.3.5 荧光定量PCR分析 使用SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）试剂盒，采用特异性引物对样品酵母菌的DNA进行qPCR检测，qPCR的反应体系为20μL，扩增体系的配制及操作流程参考试剂盒说明书。

表1 酿酒酵母实时荧光定量PCR特异性引物及其扩增条件Table1 RT-qPCR primers and amplification condition

1.3.6 还原糖和乙醇含量的测定 发酵样品中还原糖的测定参考文献[5]的方法；采用气相色谱法测定乙醇含量[5]。

1.3.7 有机酸的测定方法 采用高效液相色谱法检测发酵产物中乳酸和乙酸含量[17]。色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm×4.6mm×250mm）；流动相为0.02mol/L KH2PO4-乙腈（98：2），用磷酸调 pH值至2.3；流速 1.0mL/min；紫外检测波长：210 nm；柱温：30℃；进样量：20.0μL。

1.3.8 总酸测定 测定方法参照国标《黄酒》（GB/T 13662-2008）[18]。

1.3.9 GC-MS分析 将萃取头从顶空瓶中取出，迅速插入气相色谱仪进样口，在温度250℃下解吸5min，进行GC-MS检测分析。

气相色谱（GC）条件：高纯氦气作为载气，流速：1 mL/min；DB-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），不分流进样，进样口温度250℃；起始温度40℃，保持5min，以5℃/min升至120℃，然后以10℃/min升至240℃，保留5min；后运行温度240℃，后运行时间 5min；质谱（MS）条件：接口温度280℃；连接杆温度150℃；EI电离源，电子能量70 eV，离子源温度230℃，质量扫描范围：m/z 35～450；ACQ 方式：Scan。

1.3.10 数据分析 定性方法：通过检出物质谱图和NIST11、Wiley中标准谱图的比对检索，以及与相关文献[5，12，19-21]报道的香气描述和保留指数相比较，确证所检出红曲黄酒香气中的各种化学成分。采用HS-SPME法萃取时，对样品分析应扣除图谱中由萃取头生产的硅氧烷类杂质峰，准确地鉴定出4种红曲黄酒中的挥发性风味组分。定量方法：以2-辛醇（10mg/L）为内标进行分析，计算4种红曲黄酒中的各种挥发性风味物质浓度。采用SIMCA14.1软件，根据相关系数列出相关矩阵，并求出特征根及其相应的特征向量。根据红曲黄酒有关成分相对含量的标准化值及特征根、特征向量计算出各主成分值，并以此做主成分散点图。用R语言软件cor（）函数计算香气成分与感官指标的相关性系数，用gplots包做相关性热图。

1.3.11 感官分析 黄酒的感官评定标准主要为色泽、香气、口味和风格。具体的评定标准参考文献[22]所述方法。

2 结果与分析

2.1 不同乳酸菌对红曲黄酒酿造过程酵母菌生长的影响

酵母菌是黄酒生产的关键，其生长的优劣直接影响黄酒的品质和出酒率。酵母菌在酿造过程中具有繁殖速度快，能够在短期时间内产生较多酒精，以抑制杂菌的生长，并有一定的后生长能力，可以有效增加酒产量，产生较多的风味物质[23]。由图2可知，不同乳酸菌从发酵15 d开始对酵母菌影响各不相同，有些乳酸菌的存在会抑制酿酒酵母的生长，如接种干酪乳杆菌（Lc）后从发酵第15天开始乳酸菌数量大幅度减少。与不接种乳酸菌相比，接种不同乳酸菌在发酵后期对酿酒酵母的生长情况有较大影响。

图2 不同乳酸菌对红曲黄酒酿造过程酵母菌生长的影响Fig.2 Effects of different lactic acid bacteria on yeast growth in the fermentation of Hongqu glutinous rice wine

2.2 不同乳酸菌对红曲黄酒理化指标的影响

2.2.1 还原糖和乙醇 红曲黄酒酿造中原料与酒曲微生物相互作用，原料中的淀粉可被降解和转化为还原糖、醇类等影响黄酒品质的物质，因而酿造过程中的糖类和醇类的动态变化，尤其还原糖与乙醇含量可反应微生物的代谢活动变化趋势[24]。从图3a可知，除接种干酪乳杆菌（Lc），在发酵第10天才达到最大还原糖量后，干酪乳杆菌（Lc）与其它不同乳酸菌对发酵过程中还原糖的变化趋势大致相同，这说明接种干酪乳杆菌（Lc）对酵母菌发酵产还原糖影响不大。

由图3b可知，接种戊糖片球菌（Pp）后乙醇含量在第15～20天处下降较明显，可能是戊糖片球菌（Pp）转化乙醇为酯、醛等化合物的速度较其它乳酸菌快。另外，在发酵第20～30天逐渐上升，这可能由于乳酸菌分解剩余淀粉和糊精提供给酵母发酵又促进酒精度升高。而接种肠膜明串珠菌（Lm）在发酵第10～15天乙醇的增量最小，说明肠膜明串珠菌（Lm）对酿酒酵母发酵还原糖产酒精有明显的抑制作用。从第30天的乙醇含量来看，与空白（C）体系相比，添加不同乳酸菌菌株对酿酒酵母产酒精均有一定抑制作用，然而作用并不显著。

图3 还原糖和乙醇在不同酿造体系中的产量Fig.3 The yield of reducing sugar and ethanol in different brewing systems

2.2.2 有机酸 乳酸是黄酒中主要的有机酸，约占60%～70%，其次是乙酸和琥珀酸，还有少量的柠檬酸、草酸、酒石酸和酮酸等。乳酸具有降低酿造环境中pH值，抑制其它细菌和霉菌生长，并对黄酒的风味有重要作用[25]。

由图4可知，接种干酪乳杆菌（Lc）能有效提高乳酸含量达到最高，其次是植物乳杆菌（Lp）、戊糖片球菌（Pp）、肠膜明串珠菌（Lm）和乳酸乳球菌（Ll），研究表明一定量的乳酸具有防腐保鲜功效；接种不同乳酸菌均能有效提高乙酸的产量。己酸是一种刺激酸味，适量的乙酸能增强酒的风味和品质，而超过一定量时会引起酒的浑浊。

图4 乳酸和乙酸在不同酿造体系中的产量Fig.4 The yield of lactic acid and acetic acid in different brewing systems

2.2.3 总酸 黄酒中的总酸和pH值直接影响黄酒风味，其中总酸中大部分为有机酸。有机酸是黄酒中香气和呈味成分，与其它香气成分共同构成黄酒独特的芳香风味。适量的有机酸有助于保持黄酒的香气，并利于人体消化。酵母发酵产酒精和少量有机酸，乳酸菌则产生大量有机酸使总酸不断上升。

本文对发酵第30天的总酸量进行测定。一般认为酒液总酸度超过7 g/L，则称为中度超酸。由图5可知，接种干酪乳杆菌（Lc）后的总酸含量最高，由此可见，接种干酪乳杆菌（Lc）菌株后酒液出现中度超酸现象。由pH值的变化情况，可以发现植物乳杆菌（Lp）和干酪乳杆菌（Lc）的pH值变化趋势相似，在发酵第1～3天pH值大幅度下降，且pH值始终比其它体系低，这与乳酸的分析结果相一致，并且酿酒酵母菌菌数减少，可能是该体系产乳酸较其它体系多的缘故，使得酸度快速增加，酿酒酵母难以生长，菌数减少加快。

图5 不同酿造体系中酒醪液的pH值变化情况和发酵终产物的总酸比较Fig.5 Change of pH and total acids in the end products of different brewing systems

2.3 不同乳酸菌对红曲黄酒挥发性风味组分的影响

构成黄酒香气的成分主要是醇类、醛类、酯类等羰基化合物，黄酒中醇类物质主要是乙醇，其次是一些高级醇，赋予黄酒典型的醇香味[26]。黄酒中的酯类很丰富，是其香气构成的关键成分[27]。醛类是黄酒中“香”的协调成分，主要对黄酒的香气起平衡协调的作用[28]。本文对发酵第30天的酒液中挥发性化合物进行研究。从接种不同乳酸菌的酒样品中共检测出35种共有挥发性物质，主要包括醇类11种、酯类14种、醛类5种、酸类5种和其它2种。

图6 不同酿造体系发酵终产物的挥发性香气组分热图分析Fig.6 Heatmap analysis of volatile aroma constituent of its end products in different brewing systems

图7a为挥发性组分的第一和第二主成分散点载荷双标图，可以发现接种干酪乳杆菌（Lc）和乳酸乳球菌（Ll）的挥发性组分与空白体系有显著差异。其中，接种乳酸乳球菌（Ll）分布在PCA双标图的第一象限，与之密切相关的挥发性香气化合物主要是乙醛、异丁醛、乙酸异丁酯和4-乙基愈创木酚；接种干酪乳杆菌（Lc）菌株分布在PCA双标图的第二象限，与之密切相关的挥发性香气化合物主要包括丁二酸二乙酯、乙酸、乳酸乙酯、2，3-丁二醇和辛酸。图7b为挥发性组分的第一和第三主成分散点载荷双标图，依旧可以看出接种干酪乳杆菌（Lc）和乳酸乳球菌（Ll）菌株的酒液确实具有独特香气组分，空白体系与其它6种体系有显著差异。接种乳酸乳球菌（Ll）分布在PCA双标图的第一象限，与之密切相关的挥发性香气化合物主要是正丙醇、乙酸异丁酯、乙酸乙酯、2-苯乙醇和丁酸乙酯；接种干酪乳杆菌（Lc）菌株分布在PCA双标图的第三象限，与之密切相关的挥发性香气化合物主要包括乳酸乙酯、2，3-丁二醇、丁二酸二乙酯和己酸乙酯；而空白体系分布在PCA双标图的第二象限，与之密切相关的挥发性香气化合物主要为苯甲醛。

图7 不同酿造体系的挥发性香气组分主成分分析得分载荷双标图Fig.7 Principal component analysis of the volatile aroma components in different brewing systems

综合图6和图7可知，7种体系的挥发性成分的种类和含量存在显著差别，且接种干酪乳杆菌（Lc）和乳酸乳球菌（Ll）对发酵产物中挥发性风味组分的影响更为显著。这可能是由于接种不同乳酸菌菌株干扰了红曲黄酒其它微生物的生长代谢，导致发酵产物中挥发性风味成分有显著区别。

由图8可知，接种不同乳酸菌能显著增加草酸乙酯和苯甲酸含量，并降低正丁醇、苯甲醛和乙酸异戊酯含量。接种不同乳酸菌的体系产生挥发性组分也存在差异性，如接种干酪乳杆菌（Lc）和植物乳杆菌（Lp）能显著增加辛酸和乳酸乙酯的产量，接种乳酸乳球菌（Ll）能显著增加辛酸乙酯、正丁醇和草酸乙酯的产量，而不接种乳酸菌的空白组能显著降低苯甲醇的产量。因此，有必要对产生的挥发性物质与黄酒风味和感官特性进一步的分析。

图8 不同乳酸菌对红曲黄酒中9种挥发性风味物质产量的影响Fig.8 Effects of different lactic acid bacteria on the yield of volatile flavor compounds in Hongqu glutinous rice wine

2.4 不同乳酸菌对红曲黄酒感官品质的影响

对发酵30 d后的酒液进行感官品评分析，综合评价6种不同乳酸菌对红曲黄酒感官品质的影响。由表2中可以看出，添加了戊糖片球菌（Pp）进行强化发酵的酒样在各种感官指标上明显优于其它组，而添加其它乳酸菌菌株的酒液的感官指标均比空白体系低，尤其是添加干酪乳杆菌（Lc）的酒液得分最低。综上，添加戊糖片球菌能够提升其感官分析的各项指标，而其它乳酸菌则相反。

表2 感官评定结果Table2 The results of sensory evaluation

由图9可知，感官总分与正丁酸、苯乙醛、2-苯乙醇、乙酸异戊酯、正丙醇和1-壬醇具有正相关，与乙酸丁酯、辛酸、乳酸乙酯、葵酸乙酯、辛酸乙酯、正丁醇和5-甲基糖醛呈负相关。草酸乙酯、苯甲醛和乙酸与风味和口味呈正相关，与香气出现了相反的关系。

图9 挥发性物质与感官指标的关联分析Fig.9 Correlation analysis of volatile substances and sensory index

3 结论

研究接种不同乳酸菌对红曲黄酒发酵中酵母菌、还原糖和乙醇产量的影响。可以发现，与空白体系相比，接种不同乳酸菌菌株在发酵后期对酿酒酵母的生长有较大影响，干酪乳杆菌（Lc）对酿酒酵母的生长出现明显抑制作用，而其它体系都出现不同程度的促进作用。接种巴氏葡萄球菌（Sp）和戊糖片球菌（Pp）能有效提高酵母菌产还原糖能力，然而接种肠膜明串珠菌（Lm）、植物乳杆菌（Lp）和干酪乳杆菌（Lc）对酵母菌产还原糖具有抑制作用；从乙醇的终含量来看，虽然添加不同乳酸菌菌株对酿酒酵母产酒精有一定的抑制作用，但作用不显著。

在接种不同乳酸菌菌株的红曲黄酒中共检测到34种主要挥发性成分，主要有醇类11种、酯类14种、醛类5种、酸类5种和其它2种。接种不同乳酸菌能显著增加草酸乙酯和苯甲酸含量，并降低正丁醇、苯甲醛和乙酸异戊酯含量。接种干酪乳杆菌（Lc）能显著增加辛酸和乳酸的产量，而接种乳酸乳球菌（Ll）能有效增加辛酸乙酯和正丁醇挥发性物质。并发现正丁酸、苯乙醛、2-苯乙醇、乙酸异戊酯、正丙醇和1-壬醇与感官总分呈正相关，乙酸丁酯、辛酸、乳酸乙酯、葵酸乙酯、辛酸乙酯、正丁醇和5-甲基糖醛与感官总分呈负相关；草酸乙酯、苯甲醛和乙酸与风味和口味呈现正相关，与香气出现了相反的关系。

戊糖片球菌的添加能够提升酒液感官分析的各项指标，其它乳酸菌则相反，尤其是植物乳杆菌或干酪乳杆菌的添加均会对红曲黄酒酿造体系有着不利影响。因此，戊糖片球菌是潜在的可以应用于酿造红曲黄酒的优良乳酸菌菌株。