鲤春病毒血症病毒的致病机理及防治研究进展

孙翰昌，蔡明成

（重庆文理学院园林与生命科学学院，重庆 永川 402160）

鲤春病毒血症（Spring viremia of carp，SVC）是由SVC 病毒（SVCV）引起的一种严重的传染性病毒病，可造成鲤科（Cyprinidae）鱼类大量死亡[1]。SVCV 属于弹状病毒科（Rhabdoviridae），水泡病毒属（Vesiculovirus），是 一 种 负 义 单 链RNA 病 毒[2]。SVCV 的 基 因组、结构特征及其编码蛋白的研究较多，但其作用机制的研究还处于探索阶段，有研究认为SVCV 感染诱发的氧化应激和细胞凋亡是其致病的重要途径[3-4]。在药物治疗方面，血红素加氧酶1（Heme Oxygenase-1，HO-1）[3]和香豆素[5]被认为具有抗SVCV活性。在疫苗研究方面，SVC 疫苗质量与其种类、接种途径和保护率相关，而目前还没有商品化疫苗。总体来说，对于SVC 的监测需要更广的范围（包括地域、鱼的种类），SVCV 的致病机理需要更深入的研究，以构建有效的预防与治疗制度，减少SVC 带来的经济损失。

因此，本文主要对SVCV 的生物特性、致病机理以及对SVC 药物预防和疫苗开发等方面的研究进展进行综述，旨在总结归纳SVCV 相关的理论研究基础，了解与SVC 药物和疫苗相关的新技术和新方法，为该病毒疾病预防及绿色渔业发展积累参考资料。

1 SVCV 的研究进展

1.1 SVCV 的结构特征SVCV 外形为子弹状，长80 nm～180 nm，直径为60 nm～90 nm[1]。其ssRNA 基因组大小约11 kb，编码5 种结构蛋白：核蛋白（N蛋白）、磷酸蛋白（P 蛋白）、基质蛋白（M 蛋白）、糖蛋白（G 蛋白）和病毒依赖的RNA 聚合酶蛋白（L 蛋白）。其中G 蛋白主要通过形成三聚体诱导细胞的膜内吞作用，是SVCV最重要的抗原呈递蛋白[6]。N蛋白是高度富集的病毒蛋白，在RNA 互作中起重要作用；P蛋白包含了309个氨基酸残基，在与N蛋白和L蛋白结合中发挥作用；M 质蛋白位于SVCV 胞质和囊膜之间，与胞内的糖蛋白胞质结构域相互作用，协助病毒的装配和出芽；L 蛋白主要通过N 端与磷蛋白相结合，C 端与核蛋白相互作用来发挥自身酶活性，促进病毒的复制与转录[7]。SVCV的基因组中包含了一段潜在的N基因转录启始序列，即AACAG。另外，其每个基因的末端存在一个保守的转录终止序列TATG（A）7[8]。

1.2 SVCV 的遗传多样性SVCV 大致可分为亚洲型和欧洲型。根据其G 蛋白序列的不同，SVCV 被进一步分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc 和Ⅰd 4 种亚型[8]。其中Ⅰa亚型包含了从亚洲、欧美分离出来的病毒株；Ⅰb和Ⅰc 主要是从东欧分离出来的病毒株；Ⅰd 主要是从英国和一些欧洲国家分离出来的病毒株。然而，至今只有5 种病毒株的序列被完整地揭示，包括Fijian、Bjorklund、SVCV-A1、SVCV-C1 和SVCV-265。这5 种病毒株中均存在特异的氨基酸，且在5种蛋白中均有发现，可能是引起疾病临床症状差异化表现的原因。

2 SVCV 的致病机理

2.1 SVCV 的附着与侵入病毒的侵入是一个较为复杂的过程，包含病毒与宿主细胞的识别、附着、侵入和自我复制等方面。更深入了解其感染机制可为疾病的治疗提供有效的靶点，然而目前关于SVCV 的感染机制研究相对较少。已有研究表明，SVCV 主要通过G 蛋白参与细胞识别，并附着于细胞膜上。对于大多数病毒来说，病毒感染促使宿主细胞分泌大量炎症因子（如TNF-α）以阻断病毒的粘附，然而SVCV 的附着不受TNF-α 的抑制[9-10]。随后，在细胞胞吞作用下SVCV 被内吞到细胞膜内，其G 蛋白的构象发生改变，触发病毒由核内体向细胞质中释放，完成其侵入细胞过程[9]。另外，SVCV的G 蛋白还可激活宿主细胞mTOR 信号通路介导的细胞自噬反应，促进其自身基因组的复制[11]。

2.2 SVCV 与细胞自身免疫反应哺乳动物细胞表面存在多种类受体，触发机体自身免疫反应，抑制病毒的侵入和增殖[12]。主要包括TLRs（Toll-like receptors，TLRs）、RLRs（Retinoic acid-inducible gene 1 like receptors，RLRs）和HIN-200 家 族 受 体 等。其中，RLRs 可通过RNA 解旋酶结构域识别病毒RNAs，激活线粒体抗病毒信号蛋白（Mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS）并发挥重要作用，包括病毒诱导信号适配体和IFN-β 启动刺激因子1等[12]。在 斑 马 鱼（Danio rerio）中，MAVS 和RIG-1（Retinoic acid-inducible gene 1，RIG-1）共 同 参 与SVCV 感染的调节。其中，RIG-1 存在两个异变体（RIG-1a 和RIG-1b），RIG-1b 可通过激活IFN 抑制SVCV 活 性[13]；MAVS 有 两 个 变 异 体，MAVS-tv1 和MAVS-tv2，但是其具体的调控作用并不清楚。而SVCV 的N 蛋白可靶向MAVS 抑制IFN1 的生成，促进SVCV 的增殖[14]。

2.3 SVCV 与氧化应激反应氧化损伤被认为是SVCV 感染的致病机制之一，鲤（Cyprinus carpio）抗氧化能力的提高可作为抵抗病毒的有效手段。近年来，研究发现HO-1 在病毒感染引起的氧化应激、炎症以及细胞凋亡等生物学过程中均具有重要作用[3]。HO-1 是一种高度诱导性异型酶，催化亚铁血红素产生一氧化碳、胆红素和铁离子，抵抗氧化应激[14]。在人类中，HO-1 主要通过催化胆红素诱导IFN 和一氧化氮分泌来抑制病毒的复制[15]。在HO-1调控网络中，核转录因子EF-E2 相关因子2（Nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）作为HO-1 的上游调控因子，参与SVCV 的感染过程。在鲤鱼上皮瘤细胞（Epitheliomapapulosumcyprini，EPC）中发现，Nrf2 ARE 信号通路的激活可抑制SVCV 的增殖[16]。且Nrf2的激活可促进HO-1 和超氧化物歧化酶的分泌，进一步证实了Nrf2 和HO-1 之间的调控作用[17]。另外，HO-1 主要通过cGMP/PKG 信号通路促进一氧化碳的生成，最终抑制SVCV 的复制[3]。

2.4 SVCV 与细胞凋亡病毒感染过程伴随着细胞凋亡，但各类病毒引起细胞凋亡的作用方式不尽相同，是一个复杂的过程。一方面，细胞凋亡与病毒在宿主体内的自我复制相关；另一方面，病毒诱导的细胞凋亡造成大量细胞死亡。然而，病毒的基因组大小决定了细胞凋亡是由病毒自我复制或诱导所引起。比如，与小基因组病毒相比，较大基因组的病毒具有更强的能力去改变宿主细胞的凋亡过程[18]。SVCV（小基因组）无法通过编码基因来改变细胞凋亡过程；而疱疹病毒则可通过表达与宿主同源的基因来干扰机体免疫反应和与细胞凋亡相关的信号通路[19]。人疱疹病毒（较大基因组）主要通过表达抑制细胞凋亡的同源蛋白Bcl-2、LANA 和vIL6 来抑制p53 和IFN-α 介导的细胞凋亡[20]。在EPC 细胞中，SVCV 能够引起细胞体积减小、胞质出现空泡以及细胞核聚合和片段化，促进细胞凋亡[21]。Kazachka 等认为，SVCV 的复制以及子代病毒粒子的不断产生是促进细胞凋亡的原因[22]。进一步研究发现，SVCV 通过促进p53 和Caspase-9 基因的表达，抑制细胞凋亡相关基因IAP 的表达。此外，SVCV 还可抑制HO-1 基因表达水平以促进细胞凋亡[23]。

3 SVCV感染的药物治疗及疫苗开发

3.1 SVCV 的药物治疗目前，针对SVCV 相关药物的研究较多，但尚无商品化的特效药。Shen 等研究发现一种牛蒡子苷元衍生物[Benzimidazolecoumarin derivative，7-（4-benzimidazole-butoxy）-coumarin，BBC]可抑制SVCV 感染，其作用原理为：（1）抑制SVCV 的G、P 和N 蛋白的表达；（2）促进IFN-γ、IFN-φ1 和IFN-φ2 基因的表达，维持氧化还原反应的平衡，提高机体的抗病毒能力，保护机体免受SVCV 感染引起的损伤[24]。在中药香豆素类化合物B4 和C2 对SVCV 的抑制率达到90%以上。从对SVCV 感染后的细胞结构观察发现，B4 和C2 可保持细胞骨架结构和微结构的完整性，防止细胞凋亡[5]。此外，香豆素类化合物D5 可通过影响SVCV G蛋白的结构，干扰SVCV 与细胞表面的附着，从而抑制病毒的感染。另一方面，D5 还可通过调节Akt-mTOR 信号通路抑制SVCV 诱导的细胞自噬[5]。

此外，新技术的应用也是治疗SVCV 感染的手段之一。其中，RNA 干扰（RNA-mediated interference，RNAi）技术已被应用于药物治疗。在鱼类疾病研究中，可以通过RNAi 技术开发相关药物治疗病毒引起的各种疾病。例如，鱼β-罗达病毒表达一种名为B2 的小型蛋白，可与病毒dsRNA 结合，防止其被Dicer 酶切割，从而抑制RNAi 技术相关药物对病毒dsRNA 的沉默作用[25]。另一项关于草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）的研究发现，GCRV 的dsRNA 可激活RNAi 机制，促进肝脏中Dicer 酶的高表达[26]。另外，针对于SVCV 的N 和P 转录本进行siRNA 设计，发现该siRNA 可有效抑制病毒N 和P 基因的表达，抑制SVCV 的复制[27]。

3.2 SVCV 的疫苗开发SVCV 的疫苗研制还处于探索阶段，主要有灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗。其中，灭活疫苗保护率低，且保护持续时间较短；弱毒疫苗存在较多限制，主要包括病毒弱化不当、保护效果的定量评估、病毒毒力返强隐患以及市场限制和法律监管等。在DNA 疫苗研发方面，从三文鱼胰腺疾病的DNA 疫苗被认证后，鱼类DNA 疫苗向商业化跨出重要的一步。至今，关于鱼类弹状病毒科的有效DNA 疫苗的报道较多，如虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、大菱鲆（Scophthatmus maximus）以及太平洋鲱鱼（Clupea pallasi）的病毒性出血败血症病毒DNA 疫苗[28]。然而，SVCV DNA 疫苗的保护效果却不理想，明显低于其它弹状病毒科疫苗。为此，Kanelllos 等根据SVCV G 蛋白设计了10种DNA 疫苗，但其保护率仅在11%～33%之间；而使用表达全长G 基因的二联苗时，其保护率提高到48%[29]。最近，对SVCV-G DNA 疫苗的研究发现，其对鲤鱼提供的保护率高达100%，且该疫苗主要通过激活B 细胞和T 细胞，为鲤鱼提供获得性免疫反应[28]。虽然DNA 疫苗被认为是有效的抗病毒手段，但动物的应激反应、劳动力以及高成本限制了DNA 疫苗的大规模使用。在亚单位疫苗方面，口服乳酸杆菌融合表达SVCV-G 基因的疫苗后，对鲤鱼的保护率达到71%，而对锦鲤（Cyprinuscarpio haematopterus）的保护率为53%[30]；利用昆虫杆状细胞表达的SVCV 亚单位疫苗浸浴免疫后，对鲤鱼的保护率最高仅为34%[31]。

随着纳米技术的不断发展，具有优越的跨膜性、承载能力强及稳定性好的碳纳米管在疫苗接种方面具有广泛的应用。虽然有报道碳纳米管注射会引起毒性反应，但进一步对碳纳米管进行功能化修饰后，其引起的毒性不明显[32]。因此，碳纳米管的使用有望解决水产动物中疫苗接种途径的难题。Zhu 等以碳纳米管作为疫苗载体，装载草鱼呼肠孤病毒vp7 基因的DNA 疫苗，接种草鱼后发现该疫苗可激活机体先天和获得性免疫反应，且持续时间较长，与传统的DNA 疫苗相比，其对草鱼最高相对保护率为100%[33]。另外，浸浴和注射单壁碳纳米管SVCV 疫苗可显著提高鲤的血清抗体效价水平以及抗氧化能力，与免疫相关基因（如TNF-α、IL-10以及Cxcr1 等）的表达水平显著升高，其免疫保护率分别高达63.5%和73.1%[34]。

目前研发的SVCV 疫苗虽然成本、接种途径和保护率三方面不能满足规模化生产以及市场投放。但是，从已有的研究可知，DNA 疫苗在保护率方面具有较明显优势，尤其是针对于SVCV G 基因为靶点的DNA 疫苗。再结合纳米技术的运用，可解决SVCV 疫苗在接种途径和效率中的限制，相对减少成本投入，有望实现SVCV 疫苗的成功研制。

4 小结与展望

鲤是我国养殖历史最悠久的大宗淡水鱼类养殖品种之一，近年来，鲤（包括锦鲤）暴发性死亡的现象时有发生，呈现出发病速度快、死亡率高的特点，病害严重时发病后3 d 内死亡率达到90%以上，经前期流行病学调查和实验室检测，发现SVCV 是造成该类病害的主要病原之一。目前，SVCV 基因组序列、蛋白组成和病毒结构的研究已比较清楚，但致病途径和机理还需深入研究，治疗药物和疫苗还具有很大的开发前景。因此，结合已有的研究结果，拟从以下几方面对SVCV 进行研究：（1）进一步优化鲤养殖环境因子、营养指数、群体行为特性的各技术环节，智能化监测鲤健康养殖过程中的各类参数，动态调整鲤预防技术指标，培育无特定病原鲤亲本，繁育无特定病原（鲤春病毒、锦鲤疱疹病毒等）的鲤苗种；（2）以SVCV 的G蛋白作为靶点，研究并筛选阻断病毒与细胞附着的药物；（3）通过碳纳米管-甘露糖-SVCV 疫苗复合物，积极研究和开发SVCV DNA 疫苗；（4）探索一种基于激活鲤自身特异性免疫与生物药物相结合的鲤病毒性疾病生物防控技术体系，为提高商品鲤养殖品质及养殖效益奠定基础。