特异质型药物性肝损伤发生机制及其评价方法的研究进展

潘韵铮，胡洋，李庆菊，蒋宝平，许立

（南京中医药大学药学院，江苏省中药药效与安全性评价重点实验，江苏南京 210023）

2014 年，美国胃肠病学会发布的《药物性肝损伤诊断和治疗新版指南》中将药物性肝损伤（druginduced liver injury，DILI）分为固有型DILI 和特异质型DILI（idiosyncratic DILI，IDILI）［1］。固有型DILI具有可预测、潜伏期短和有明显的剂量依赖性等特点，而IDILI 则不表现出简单的剂量依赖性，但它可能与患者的性别、年龄、基因和基础疾病等存在某种关系，潜伏期长且不稳定，具有难以预测的特点［2］。近年来，有关化学药和中草药导致IDILI的报道在增加，不少已经获得批准的药物因IDILI而从市场上撤回或受到“黑框”警告，这不仅提高了制药企业研发新药的成本，还增加了临床用药的风险。因此，预测药物发生IDILI 的风险，发现新的IDILI 生物标志物，建立高效、准确的IDILI 评价模型已经成为药物研发中的热点。本文主要对IDILI 的发生机制假说、预测IDILI 的生物标志物以及IDILI 的评价模型进行综述，以期为IDILI 的机制研究、风险药物的筛选和临床相关疾病的治疗提供参考。

1 特异质型药物性肝损伤发生机制

IDILI发生机制十分复杂，目前研究主要从代谢和免疫2个方面提出了IDILI发生机制的一些假说，并将IDILl划分为代谢IDILI和免疫IDILI［3］。

1.1 肝代谢功能障碍假说

目前研究证实，很多药物导致的肝损伤是由肝代谢功能障碍引起的，肝代谢能力降低可导致原形药物在肝中积累而诱发肝损伤；相反，代谢能力增强可导致活性代谢物的形成，某些活性代谢物可以与蛋白质共价结合，从而干扰蛋白质功能并启动细胞死亡［4］。由于遗传因素和环境因素的影响，药物在个体间的肝代谢能力存在差异性［5］。此外，个体间活性代谢物失活能力的差异可以影响这些代谢物的毒性潜能。所以有充分的理由认为，药物代谢和转运的个体差异在IDILI 中发挥着重要作用。事实上，这已经成为解释IDILI的一种流行假说。

药物在肝中的代谢分为Ⅰ相和Ⅱ相2个反应阶段，其中Ⅰ相代谢发生氧化、还原和水解反应，Ⅱ相代谢发生结合反应［6］。研究发现，双氯芬酸导致的IDILI与编码Ⅰ相代谢酶细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）和Ⅱ相代谢酶尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT）的基因多态性有关，代谢酶的多态性使个体更容易形成或积累双氯芬酸活性代谢物［7］。双氯芬酸活性代谢物可能与肝内蛋白质结合形成加合物使易感患者产生肝损伤［8］。除代谢酶，肝中的转运蛋白也参与许多药物的代谢过程。近年来，研究人员基于细胞和动物模型已经探索出几种与IDILI 相关的药物转运体。例如，有机阴离子转运蛋白和多药耐药相关蛋白2 参与了曲格列酮硫酸盐在体外肝细胞中的积累；曲格列酮及其在胆汁中的硫酸盐代谢物竞争性地抑制胆汁盐输出泵对胆汁酸的消除［9］；曲格列酮还可以抑制在夹层培养的人肝细胞中的胆汁盐输出泵［10］。由于这些转运体对胆汁酸和胆红素在肝细胞内的分布具有重要作用，因此这些转运体受到抑制可导致个体胆汁淤积和肝损伤。与药物代谢相似，药物诱导的肝胆转运改变可能与其他因素共同作用，从而使个体对IDILI 易感。

1.2 炎症应激假说

炎症反应存在于多种疾病中，并且也是IDILI的主要症状之一。ROTH 等［11］首次提出了药物与炎症物质联合应用导致机体肝损伤的炎症应激假说，他研究发现，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）与雷尼替丁等药物联用可导致肝损伤。MENG 等［12］采用低剂量LPS造成大鼠炎症应激模型，评价了何首乌的肝毒性，并发现过氧化物酶体增殖物活化受体γ通路的异常抑制和相关炎症因子过表达是何首乌致免疫性IDILI的诱因。SU等［13］发现了安全剂量的LPS与异烟肼联用可引起大鼠肝损伤，观察到大鼠肝组织中胆汁酸转运蛋白、胆汁盐输出泵和多药耐药蛋白2 在基因和蛋白水平上的下调，并认为胆汁排泄障碍是异烟肼诱导肝毒性的主要原因。另有研究发现，用肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）代替LPS 与曲伐沙星联用仍然可以诱导肝损伤［14］，提示炎症因子在IDILI发生过程中起着重要作用。炎症应激引起的IDILI 主要与患者机体存在炎症环境相关，这提示患者在自身患有炎症性疾病时，应尽量避免服用有IDILI风险的药物。

1.3 半抗原假说

半抗原假说是指当药物或其代谢产物与机体内的蛋白共价结合形成药物/代谢产物-蛋白加合物时，其作为半抗原可被抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APC）加工后被T细胞识别并诱发强烈的免疫反应［3］。目前在人类和动物模型上研究最广泛的与半抗原假说有关的IDILI 药物是氟烷。氟烷曾经是一种被广泛使用的麻醉剂，在使用该药麻醉的患者中，约20%患者出现临床上较为轻微的肝损伤，仅有极少数患者出现非常明显的肝损伤，因而氟烷导致的肝损伤可能存在个体差异。在死于氟烷型肝损伤的患者中，肝损伤通常表现为小叶中心肝细胞坏死、脂肪变性和炎症细胞增生［15］。研究发现，氟烷在肝中被CYP2E1 代谢为三氟乙酰氯，与肝中蛋白质或脂质形成加合物，这些加合物作为半抗原引发强烈的免疫反应导致肝损伤，并且在暴露于氟烷的动物模型上检测到针对三氟乙酰氯-蛋白质加合物的抗体［16］。另外，双氯酚酸和异烟肼也可以经肝代谢后形成代谢产物-蛋白加合物诱导肝损伤［17］。除与肝蛋白相结合外，氟氯西林及其代谢产物5-羟甲氟氯西林可与血清白蛋白结合导致肝损伤［18］。药物及其代谢产物与非肝蛋白结合导致肝损伤的机制还有待进一步研究。

1.4 危险因子假说

危险因子假说是指药物或代谢产物及其加合物导致细胞损伤或应激反应，进而诱发损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）的释放，DAMP 则激活APC 和免疫反应，诱导IDILI 的发生［3］。KATO 等［19］使用FLC-4 肝癌细胞与THP-1源巨噬细胞结合，评价奈韦拉平和阿莫地喹的IDILI 风险。结果发现，2 种药物与FLC-4细胞孵育7 d后的上清液导致THP-1细胞炎症小体的激活，认为IDILI风险药物在肝细胞的活性代谢物可以引起危险因子DAMP的释放，而DAMP的释放可以激活巨噬细胞炎症小体。免疫系统对抗原的识别主要由T 细胞受体（T cell receptor，TCR）介导的主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-肽段抗原识别通路（第一信号通路）和危险因子介导的APC 活化信号通路（第二信号通路）共同发挥作用［20］。药物与蛋白质的共价结合可产生被特定T 细胞识别的新抗原，这向T 细胞传递了所谓的第一信号通路；DAMP 作为刺激因子诱导APC 表达CD80，CD86 和CD40 等共刺激因子，且这些共刺激因子提供第二信号通路。激活T细胞和免疫反应均需要上述2 种信号。因此，可以认为危险因子假说与半抗原假说是互补的。

1.5 免疫稳态失衡假说

研究表明，临床上大多数的IDILI 是免疫介导的。然而在许多IDILI 患者中，尽管继续使用IDILI风险药物治疗，肝损伤的情况仍然可以消退，这表明肝的主要免疫反应是免疫耐受［21］。免疫稳态失衡假说是指肝的免疫耐受因某种因素被破坏，使得肝对药物的易感性增强，从而导致IDILI 的发生。MAK 等［22］使用细胞毒性T 淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4）抗体治疗的程序性死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）基因敲除小鼠建立一种免疫耐受受损的动物模型，评价了曲格列酮/吡格列酮和托卡朋/恩托卡朋2 组结构相似的药物。通过血清生化指标和组织病理特征表明，曲格列酮和托卡朋分别与CTLA-4 抗体联合治疗可以引起PD-1基因敲除小鼠严重的肝损伤，而吡格列酮和恩托卡朋则未引起明显的肝损伤。免疫稳态的失衡主要与患者基础疾病、体质和遗传等因素有关，为降低IDILI 发生概率，临床上应避免同时服用具有潜在IDILI风险的药物和免疫调节类药物。

1.6 人类白细胞抗原基因多态性假说

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是人类MHC 的表达产物。HLA基因编码人类MHC受体。根据其编码分子结构可分为MHCⅠ类、MHCⅡ类和MHCⅢ类分子，其中MHC Ⅰ由HLA-A，HLA-B和HLA-C编码，MHC Ⅱ由HLA-DP，HLA-DQ和HLA-DR编码［23］。MHC Ⅰ位于一般细胞表面，可供CD8+T细胞识别启动免疫反应；MHC Ⅱ位于APC上，辅助T细胞启动免疫反应［24］。有研究报道，HLA等位基因的特异性与IDILI之间存在明显的相关性［25］。奈韦拉平诱导的IDILI 与HLA-B＊35：05等位基因存在相关性［26］，氟氯西林诱导的胆汁淤积性IDILI 和HLA-B＊57：01等位基因存在相关性［27］，中药何首乌诱导的IDILI 与HLA-B＊35：01等位基因相关［28］。特异性HLA基因与IDILI之间的相关性为其免疫机制提供了强有力的证据。然而，HLA基因多态性诱导IDILI 的相关机制尚不清楚。除HLA基因多态性，药物代谢酶和解毒酶相关的基因多态性也可能与IDILI的发生相关。例如，曲格列酮诱导的IDILI 与谷胱甘肽S-转移酶互补基因的无效突变相关［29］。

2 预测特异质型药物性肝损伤的生物标志物

根据IDILI 的临床特征，其主要分为3 种类型：肝细胞性肝损伤、胆汁淤积性肝损伤和自身免疫性肝炎［30］。预测IDILI 的理想的生物标志物应具有较强的灵敏性、稳定性、组织特异性及个体关联性，能够反映IDILI的临床特征和发展进程，并且检测方法简单便捷。谷丙转氨酶（glutamic pyruvic transaminase，GPT）和谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase，GOT）是目前临床上评价肝毒性最常用的生物标志物，并被视为预测和诊断肝损伤的“黄金标准”［31］。但由于非肝损伤或非药物因素导致的肝损伤也可能引起其升高，如降血脂药非诺贝特能通过激活启动子显著增加GPT基因表达，从而引起非病理性GPT升高［32］；长期以快餐食品为基础饮食也会导致肝损伤而引起血清GPT和GOT水平上升［33］，这使其在预测IDILI 应用中受到一定限制。随着研究的不断深入，目前发现了能够预测IDILI的生物标志物包括高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB1）、角蛋白18（keratin-18，K18）和微RNA（microRNA，miRNA）等。

2.1 高迁移率族蛋白B1

HMGB1是存在于真核细胞中的一类与细胞核内转录、DNA 修复和核小体组装相关的非组核蛋白［34］。细胞核外的HMGB1 是重要的炎症介质，它在多种疾病中可由死亡或受损的细胞被动释放，参与细胞、组织的炎症和坏死过程［35］。外分泌的HMGB1 可以与细胞膜上的Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）或晚期糖基化终产物受体（the receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）结合，从而通过募集免疫细胞和诱导细胞因子释放来促进炎症反应。DONG等［36］发现，大鼠ig给予雷公藤甲素溶液后，其血清和肝组织中的HMGB1 水平显著升高，并且证实HMGB1-TLR4 介导的炎症通路在雷公藤致大鼠肝损伤中发挥了重要作用。炎症应激可引起IDILI，而HMGB1作为一种重要的炎症介质在血浆中升高通常早于GPT，并且经过修饰后高度乙酰化和二硫亚型的HMGB1在血浆中可以稳定存在［35，39］，对IDILI的严重程度和预后判断有重要医学价值。因此HMGB1可作为预测IDILI的生物标志物。

2.2 角蛋白18

中间丝是细胞骨架蛋白，角蛋白是其最大的亚家族蛋白，它主要以特定角蛋白对的形式表达于上皮细胞，具有维持上皮组织完整性和连续性的功能。K18 是在多种肝疾病患者Mallory-Denk 体中发现的磷酸化中间丝蛋白［37］。在细胞发生凋亡时，K18可以被胱天蛋白酶切割后释放到外周血液循环中，并随时间积累［38］。ANTOINE 等［39］结合组织学和蛋白组学技术，用对乙酰氨基酚诱导的肝毒性模型小鼠发现，血清中出现的胱天蛋白裂解K18（细胞凋亡指标）和全长K18（细胞坏死指标）与细胞死亡的组织学时间进程有较强的相关性。在肝细胞性肝损伤中，K18 对于细胞死亡的敏感性高于GPT，在GPT水平升高前即可显著升高。因此，K18有望成为预测IDILI的生物标志物。

2.3 微RNA

miRNA 是一类在转录后调节基因表达水平的内源性非编码单链RNA。通常miRNA在体液中的含量相对稳定，只有当器官受损时外周血液中的miRNA 含量才会增加［40］。近年来研究表明，部分miRNA 可以作为疾病和毒性的生物标志物。KIA等［41］使用对乙酰氨基酚和双氯芬酸研究了miR-122作为药物毒性的肝细胞富集生物标志物在人原发性肝细胞和肝癌细胞中的潜在应用，并比较了miR-122毒性试验与传统细胞毒性试验在检测药物引起的肝细胞微扰方面的敏感性。结果表明，miR-122 可以作为药物诱导的肝细胞毒性的敏感生物标志物。miRNA 作为药物性肝损伤的生物标志物具有一定的优势。首先，血液中的miRNA 比GPT 等传统生物标志物更敏感。研究发现，在药源性肝损伤患者中，miR-122 的血清水平在刚发生肝损伤的患者中比恢复中的患者高110%，而GPT 的差异仅为3.5%。其次，研究发现，血液中的miRNA在检测肝损伤方面比传统生物标志物更具有器官特异性，有助于区分肝损伤和肝外器官损伤［42］。总之，miRNA的组织特异性和体液稳定性等优势使其具有作为预测IDILI生物标志物的潜能。

3 特异质型药物性肝损伤相关药物的评价模型

预测药物产生IDILI的风险，建立高效、准确的IDILI 评价模型已经成为新药研发中的热点。近年来，基于IDILI发生的相关机制尝试建立了一些用于评价和筛选IDILI风险药物的体内和体外模型。

3.1 炎症应激模型

炎症应激模型是基于炎症应激的IDILI 发生机制假说所建立的，它是目前研究最广泛的IDILI 模型。在体内研究中，常使用低剂量的LPS造成动物轻度炎症，然后施加药物造成IDILI。目前炎症应激的动物模型已成功应用于双氯酚酸、雷尼替丁、氯丙嗪、曲伐沙星和三氟溴乙烷等IDILI风险药物评价中。另外，炎症应激模型还可以应用于体外药物肝损伤的评价研究。HADI 等［43-44］利用小鼠和人的精密肝切片建立与炎症应激相关IDILI 体外评价模型，通过这2种精密肝切片模型检测出酮康唑、氯氮平、双氯芬酸钠和曲格列酮4 种IDILI 风险药物与LPS 联用表现明显的肝毒性。COSGROVE 等［45］将LPS 及TNF-α、干扰素γ、白细胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）和IL-6 等细胞因子与不同药物联合应用，并在HepG2细胞和肝原代细胞上大规模成功筛选出具有IDILI 风险的药物。炎症应激模型由于其使用的LPS及细胞因子价格相对较低，造模方法简单，且具有体内和体外均适用的优势，因此该模型可用于大规模IDILI风险药物的筛选。

3.2 免疫耐受抑制模型

免疫耐受抑制模型是基于免疫稳态失衡的IDILI发生机制假说而建立的。癌症化疗的一个有希望的领域涉及免疫检查点抑制剂的使用，它可以通过破坏免疫耐受促使免疫系统杀死肿瘤细胞。通过使用免疫检查点蛋白抑制剂可以建立一种与人类IDILI 非常相似的动物模型。METUSHI 等［46］发现，阿莫地喹可以导致PD-1基因敲除的雌性C57BL/6小鼠发生轻度的肝损伤，且这种损伤会逐渐消退。在此基础上，课题组又给予PD-1基因敲除小鼠CTLA-4抗体同时抑制PD-1的表达和CTLA4蛋白活性，再给予阿莫地喹时则出现了严重的肝损伤。MAK等［47］用CTLA-4抗体预处理的PD-1基因敲除小鼠评价IDILI 风险药物异烟肼和奈韦拉平的肝毒性。结果发现，这2 种风险药物与免疫检查点抑制剂同时使用会造成小鼠严重的肝损伤，说明削弱免疫耐受可能是揭示药物引起IDILI 潜能的一种方法。然而，目前免疫耐受抑制模型仅仅局限于动物研究，该评价模型使用的造模方法比较复杂且价格昂贵。因此，该模型不适合用于大规模的IDILI风险药物的筛选。

3.3 类器官培养评价模型

类器官是应用3D培养技术对器官祖细胞或干细胞在体外进行诱导分化形成的三维细胞复合体，在结构和功能上都类似于目标器官或组织［48］。LI 等［49］采用3D 类器官HepaRG 细胞体外评价模型，并结合高内涵成像技术评价了肝毒性药物胺碘酮、环孢素及阴性对照药阿司匹林的毒性差异。GRANITZNY 等［50］建立HepG2 细胞与THP-1 单核细胞或巨噬细胞的共培养评价模型，在TNF-α 或LPS 存在下对具有IDILI 风险的曲格列酮、曲伐沙星、双氯芬酸钠和酮康唑4种药物及其非IDILI的配体化合物进行了评价。结果发现，所有具有IDILI风险的药物在TNF-α 或LPS 存在下诱导严重的肝细胞损伤，证实了肝细胞与免疫细胞之间的相互作用在IDILI 个体易感性改变中起着重要作用。与传统2D 细胞培养模式相比，3D 培养的类器官改变了普通贴壁细胞间单纯的物理接触联系，增强了细胞间的生物通信，提高了细胞内药物代谢相关酶、转运体和白蛋白的水平，能更好地应用于模拟器官和组织的生理病理状态［51］，因而在生物医学研究和药物安全性评价方面具有广阔的应用前景。

4 结语

IDILI 的发生是一个综合且复杂的过程，是药物、机体和环境三者共同作用的结果，应综合考虑多种因素的影响。近年来，随着对IDILI 的研究深入，初步阐明了肝代谢功能障碍、炎症应激、半抗原、危险因子、免疫稳态失衡和基因多态性等有关IDILI 发生的机制假说，发现了HMGB1，K18 和miRNA 等可作为预测IDILI 的生物标志物。另外，研究人员也尝试建立了炎症应激、免疫耐受抑制和类器官培养等用于评价和筛选IDILI 风险药物的体内和体外模型。然而，对于IDILI的研究仍然不够成熟，某些发生机制还停留在假说阶段，缺少生物学实验的验证；一些评价模型由于成本高、操作复杂等缺点而不利于进行大规模的药物筛选。因此，今后不仅需要加强IDILI发生机制和生物标志物的研究，还应重视预测并评价IDILI 高风险药物，以降低IDILI对患者和制药企业所带来的损失。