咪唑嵌合半胱氨酸修饰固定相制备及色谱应用

王胜玉，梁鹏，段立广，乔晓强

(1. 河北大学 药学院，河北 保定 071002；2. 河北医科大学第一医院 药学部，河北 石家庄 050000)

固定相是高效液相色谱(HPLC)系统的核心部件.为了满足不同领域日益增长的分离分析需求，研究者发展了多种类型的色谱固定相材料[1-2].目前，混合模式固定相已经成为色谱研究的一个热门课题.混合模式固定相与传统的单一分离模式固定相相比，具有高选择性、高分离效率和高样品载样量等优点[3-4].已有文献报道了多种类型的混合模式固定相，并将其应用于小分子和大分子的分离，如反相液相色谱/亲水相互作用液相色谱(RPLC/HILIC)[5-7]，RPLC/离子交换色谱(IEC)[8-9]，HILIC/IEC[10-12]和RPLC/HILIC/IEC[13-14].然而，开发新的混合模式固定相以应对不断发展的分析和工业应用挑战具有十分重要的意义.

在各种混合模式固定相中，HILIC/RPLC混合模式固定相由于其优异的正交性和互补性，应用最为广泛.如利用不同极性的官能团对二氧化硅材料表面进行改性而发展的HILIC/RPLC混合模式固定相备受关注，目前文献报道的官能团有芳香咪唑基[15]、季铵[15-18]、极性酰胺[19-20]、苯胺[21]、偶氮苯[22]、多糖[23]和羟基[24-25]等.

离子液体(ILs)具有优异的热稳定性和溶解特性，这赋予了离子液体修饰的固定相更多的优势[15-16, 18, 26].其中咪唑类ILs已被广泛应用于混合模式固定相的制备[27].例如，Zhang等制备了咪唑啉固定化硅球修饰色谱固定相，并在HILIC和RPLC模式下实现了多种水溶性维生素和芳香族化合物的分离[17].在前期研究工作中[15-16, 28]，笔者发展了多种新型的基于咪唑型离子液体的改性固定相，其展示出的HILIC/RPLC混合模式机制为分离和分析不同种类和性质的物质提供了良好的选择.

为了进一步丰富HILIC/RPLC固定相并扩展其应用范围，本研究利用“点击化学”的方法引入咪唑嵌合离子液体和L-半胱氨酸(Cys)，制备了新型功能化硅胶色谱固定相(SIL-AVI-Cys).对所制备的固定相进行红外分析、元素分析和热重分析等表征，实验结果表明咪唑嵌合L-半胱氨酸已成功键合于硅球表面.填充SIL-AVI-Cys色谱柱展示了混合模式RPLC/HILIC机制及良好的分离性能，并将SIL-AVI-Cys色谱柱应用到奶粉中潜在添加三聚氰胺的检测和表征.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

5 μm球形硅胶(孔径10 nm)购自富士硅化学株式会社(日本)；Cys购自阿法埃莎(北京)；(3-巯丙基)三甲氧基硅烷(MPS)购自阿拉丁(上海)；1-烯丙基-3-乙烯基咪唑溴盐(AVI)购自华威锐科(北京)；偶氮二异丁腈(AIBN)购自伊诺凯(北京).

FT-IR实验于Bruker公司(德国)的VERTEX70光谱仪中完成；热重分析实验于Perkin-Elmer公司(美国)的TGA/SDTA851E系统中完成；元素分析由加联仪器公司(美国)的CE-440系统完成；高效液相色谱实验由大连依利特分析仪器有限公司的P230Ⅱ系统完成；填充色谱柱由无锡加莱克色谱科技有限公司的GLK100型装柱系统完成.

1.2 实验方法

1.2.1 SIL-AVI-Cys固定相的制备

SIL-AVI-Cys固定相的制备路线如图1所示.

第1步，MPS修饰硅球(SIL-MPS)的制备：参考文献[29]中合成方法，取3.0 g硅球加入到50 mL的烧瓶中，再加入无水甲苯25 mL使其充分悬浮，然后缓慢将3.1 mL MPS加入，搅拌使其混合均匀，充入氮气保护，在110 ℃条件下回流反应24 h.反应结束后将反应物冷却到室温，分别用甲苯、体积比1∶1的甲醇-水和甲醇洗涤反应产物，并于真空干燥箱中60 ℃干燥8 h后，可用于进一步后续修饰.

第2步，AVI修饰固定相(SIL-AVI)的合成：将3.0 g制备的SIL-MPS混悬于30 mL的氯仿中，并加入200 mg的AIBN作为催化剂，搅拌均匀，于60 ℃氮气保护下反应24 h.待反应停止后冷至室温，分别用氯仿、体积比1∶1的甲醇-水和甲醇洗涤反应产物.反应产物经真空干燥12 h后，可用于进一步后续修饰.

第3步，Cys修饰固定相(SIL-AVI-Cys)的制备:称取3.0 g SIL-AVI，加入40 mL体积比为1∶2的甲醇-水溶液和1.0 g Cys，继续加入160 mg 的AIBN，于60 ℃氮气保护下反应24 h.待反应停止后冷至室温，分别用体积比为1∶2的甲醇-水、甲醇洗涤反应产物，于真空干燥箱中50 ℃下干燥12 h，即得SIL-AVI-Cys固定相.

图1 咪唑嵌合半胱氨酸功能化色谱固定相制备示意

1.2.2 色谱柱填充及分离条件

色谱柱填充步骤：取2.2 g的SIL-AVI-Cys固定相，悬浮于20 mL体积比为1∶1的三氯甲烷-环己醇匀浆液中，超声混悬均匀.然后将混悬液缓慢倒入匀浆管中，连接装柱系统，并采用体积比为1∶1的异丙醇-甲醇为加压液，在40 MPa压力下装填约30 min后释放压力.静置约20 min之后将色谱柱取下，连接液相色谱系统，并以乙腈为流动相，在1.0 mL/min流速下冲洗色谱柱80 min后即可使用.

色谱分离条件：所制备的SIL-AVI-Cys色谱柱和氨基柱均在等梯度下进行分离测试.流速采用1 mL/min，柱温采用室温.核苷和核酸碱基类化合物分离采用流动相为体积比92∶8的乙腈-水，波长为254 nm；酰胺类化合物分离时采用流动相为体积比98∶2的乙腈-水，波长为214 nm；三聚氰胺和奶粉样品分离采用流动相为体积比90∶10的乙腈-水，波长为240 nm.上述样品均使用初始流动相溶解并配制为200～500 μg/mL的溶液，进样体积为5 μL.

1.2.3 奶粉样品制备

奶粉样品制备参考文献[30].取0.4 g的奶粉加入到5 mL体积分数 1%的甲酸溶液当中，混合均匀后缓慢加入乙腈至总体积为10 mL，并于15 000 r/min的转速离心10 min，将上清液收集，并采用0.22 μm滤膜过滤之后，待分析使用.

2 结果与讨论

2.1 SIL-AVI-Cys材料表征

SIL-AVI-Cys材料首先利用FT-IR光谱仪进行表征，其结果归纳如图2.在空硅球Silica的谱图中，可观测到980 cm-1特征吸收峰，为硅醇基特征吸收；经MPS修饰之后，980 cm-1峰消失，可验证MPS被成功修饰到了硅球表面；SIL-AVI谱图中，在1 560 cm-1处出现咪唑基团上C=C伸缩振动的特征吸收峰，在960 cm-1处出现咪唑侧链烯烃C—H面外弯曲振动特征吸收峰，可验证AVI被成功键合到了硅球表面.

固定相的热重分析结果如图3所示.在100 ℃左右，空硅球的质量损失约为2.0%，这是由于在硅球表面吸附的水分子随温度的升高蒸发所致；与裸硅球相比，SIL-MPS在200～800 ℃的质量损失约为4.6%，SIL-AVI及SIL-AVI-Cys固定相与裸硅球相比质量损失分别为14%和24%，这是由于固定相上键合了咪唑和半胱氨酸基团.因为固定相200 ℃以上时的质量损失一般是由于其表面存在的有机官能团丢失导致的，上述结果证明所制备的固定相具有较高的热稳定性，也进一步表明SIL-AVI-Cys固定相已被成功制备.

图2 红外光谱表征Silica、SIL-MPS、SIL-AVI和SIL-AVI-Cys色谱固定相

图3 热重分析表征Silica、SIL-MPS、SIL-AVI和SIL-AVI-Cys色谱固定相

进一步使用元素分析对材料进行表征，结果显示SIL-MPS中C、H和N元素的质量分数依次分别为3.7%、1.2%和小于0.3%；SIL-AVI中3种元素的质量分数分别增加到10.9%、1.7%和2.5%，元素质量分数增加表明AVI已成功键合到硅胶表面；SIL-AVI-Cys色谱固定相中其质量分数可进一步增至12.7%、2.1%和3.1%.以上元素分析结果可证实咪唑以及半胱氨酸均被成功地修饰到了硅球表面.

2.2 保留机制

SIL-AVI-Cys色谱柱保留机制首先使用胞核嘧啶、尿嘧啶、胞苷、尿苷和肌苷等5种亲水性物质进行了考察.当流动相中水的含量增加时，上述核苷和核酸碱基类化合物在SIL-AVI-Cys色谱柱中保留逐渐减弱(图4)，尤其是当流动相中水的体积分数从10%增加至25%时，上述物质的保留迅速降低，表明SIL-AVI-Cys固定相与强极性物质存在亲水作用，显示亲水作用色谱保留特征.

SIL-AVI-Cys色谱柱保留机制进一步采用苯酚和苯胺类化合物进行了考察.从图5可看出，当流动相中乙腈的体积分数在50%～70%时，苯酚和苯胺类化合物保留因子(k)随着流动相乙腈含量增加而逐渐减弱，显示反相色谱保留机制；随着流动相乙腈体积分数继续增加，苯酚和苯胺类化合物的保留开始逐渐增加，表明该色谱柱同时显示亲水色谱保留机制.通过以上考察分析，笔者制备的SIL-AVI-Cys固定相具有亲水/反相混合模式，但以亲水模式为主，这主要是由于SIL-AVI-Cys固定相表面具有大量的羧基和氨基，容易和流动相中的水分子相互作用，形成“水膜”层，易于和极性化合物产生强相互作用.

图4 流动相水体积分数对核苷/核酸碱基类物质保留影响

图5 流动相乙腈体积分数对苯胺和苯酚类化合物保留影响

2.3 pH及盐浓度对色谱保留影响

在亲水作用色谱中，流动相的pH值变化和盐浓度会对分析物保留产生重要的影响.于是笔者探讨了流动相的pH值及其盐浓度对物质保留的影响.pH值对分析物保留影响如图6.中性和碱性物质受pH值影响较小，这是由于pH值的变化对其离子化程度影响较小.对于酸性的苯甲酸(pKa= 4.17)，其保留随着流动相pH值的增加而逐渐增强，尤其是在pH值高于4时，其保留明显增加，这主要是因为在高pH值流动相系统中，苯甲酸逐渐从分子状态离子化，和固定相产生强的静电相互作用，故保留增加.

流动相中盐浓度变化对物质保留的影响如图7所示.对于酸性化合物苯甲酸和1-羟基-2-萘酸，物质的保留随着流动相中盐浓度的增加逐渐降低，原因可能是随着流动相中盐浓度的逐渐增加，流动相中离子强度增加，使保留减弱.然而，对中性和碱性物质而言，如烟碱、肌苷、胞核嘧啶和三聚氰胺，其保留变化不明显.

色谱条件：含10 mmol/L甲酸铵的乙腈-水(体积比85∶15)为流动相，甲酸调节pH；流速为1.0 mL/min；检测波长分别为烟碱：272 nm，苯甲酸：230 nm，肌苷和胞核嘧啶：254 nm，三聚氰胺：240 nm

色谱条件：含不同浓度甲酸铵的乙腈-水(体积比85∶15)为流动相；流速为1.0 mL/min；检测波长分别为烟碱：272 nm，三聚氰胺：240 nm，苯甲酸和1-羟基-2-萘酸：230 nm，肌苷和胞核嘧啶：254 nm

2.4 色谱分离性能

采用核苷及核酸碱基、酰胺类化合物考察了SIL-AVI-Cys色谱柱的分离效果，并和商品化的氨基柱分离效果进行了比较.

2.4.1 核苷和核酸碱基分离效果

首先使用核苷和核酸碱基类化合物评价所制备的SIL-AVI-Cys色谱柱的分离性能，并与氨基柱进行了对比.如图8a和8b所示，以体积比为92∶8的乙腈-水为流动相，4种化合物在SIL-AVI-Cys色谱柱和商品化氨基柱上均实现了分离，但是在氨基柱上所需分离时间较长.如图8c所示，进一步提高流动相中水的体积分数到11%，可以缩减肌苷在氨基柱上的保留，但造成了尿苷、腺苷和尿嘧啶分离度的降低.此外，在SIL-AVI-Cys色谱柱上，尿苷和腺苷洗脱顺序与其在氨基柱中相反，这说明SIL-AVI-Cys色谱柱与商品化氨基柱具有不同的分离选择性，原因可能是咪唑环提供了较强的π-π和疏水相互作用.

色谱条件：图a、b使用流动相为乙腈-水(体积比92∶8)，图c使用流动相为乙腈-水(体积比89∶11)；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm；分析物：1. 尿嘧啶；2. 腺苷；3. 尿苷；4. 肌苷.

2.4.2 酰胺类物质分离效果

酰胺类化合物在SIL-AVI-Cys色谱柱中的分离效果如图9a所示，选用体积比为98∶2的乙腈-水为流动相，双丙烯酰胺、丙二酰胺、烟碱和硫代乙酰胺可实现快速分离，且具有较高柱效；同样，4种物质在商品化氨基柱上也可实现快速有效分离，说明SIL-AVI-Cys色谱柱具有与商品化氨基柱相当的分离性能.

2.5 检测奶粉样品中的三聚氰胺

三聚氰胺俗称密胺、蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，由于其高含氮量特征，经常被不法分子作为乳制品添加剂，以提高乳制品蛋白的显性含量.但是，三聚氰胺聚集在人体可引发肾功能衰竭等多种疾病.笔者发展了基于SIL-AVI-Cys固定相的奶粉样品中三聚氰胺的检测方法.图10a和10b依次是三聚氰胺标准品以及奶粉样品在SIL-AVI-Cys色谱柱上的分离谱图.从图中可发现，三聚氰胺在SIL-AVI-Cy色谱柱上具有较强的保留；在当前的色谱检测条件下，未在奶粉样品中检出三聚氰胺.综上所述，笔者发展的SIL-AVI-Cys色谱柱有望用于检测和表征乳制品中非法添加的三聚氰胺.

色谱条件：流动相采用乙腈-水(体积比98∶2)；流速为1.0 mL/min；检测波长为214 nm；分析物：1. 硫代乙酰胺；2. N,N-亚甲基双丙烯酰胺；3. 烟酰胺；4. 丙二酰胺

色谱条件：流动相采用乙腈-水(体积比90∶10)；流速为1.0 mL/min；检测波长为240 nm.

3 结论

本研究设计并合成了咪唑嵌合半胱氨酸修饰固定相SIL-AVI-Cys.所制备的SIL-AVI-Cys材料具有亲水/反相混合模式的保留特征.核苷及核酸碱基类物质、酰胺类化合物均可在SIL-AVI-Cys色谱柱上实现有效分离分析，具有良好的分离性能.此外，SIL-AVI-Cys色谱柱还可实现奶粉中添加三聚氰胺的有效检测和表征.