铁线莲品种耐热性分析及评价指标筛选

刘志高 邵伟丽 申亚梅 季梦成 叶 盈

(浙江农林大学风景园林与建筑学院,浙江杭州 311300)

铁线莲属(Clematis)植物被誉为“藤本皇后”,花色艳丽、花型多样,是家庭园艺和城市绿化的优良材料。观赏铁线莲品种多以欧洲为育种起源地,适宜在冷凉干燥的环境下栽培,目前已有超过400个品种在世界各地广泛种植[1]。我国上海市和浙江省自本世纪初开始引进观赏铁线莲品种,深受园艺爱好者喜爱。相对于地理纬度较高的欧洲,江南地区的气候更加温暖,夏季高温易引发铁线莲茎叶热害。如杭州夏季常出现40℃高温天气,致使植株叶片萎蔫脱落、茎秆枯萎,甚至整株死亡,观赏价值大打折扣,同时造成光合效率下降,有机产物积累受阻,影响翌年营养生长和开花。目前有关铁线莲耐热生理及耐热品种选育的研究较少,仅限于对皇帝、落日等少数几个品种耐热性的比较[2],评价体系尚有待完善。此外,植物耐热能力是一个复杂的综合性状,仅靠少量通用指标难以对耐热性强弱进行准确评判[3-4],因而借助多元统计方法对植物耐热性进行综合评价更为科学合理[5]。

浙江农林大学观赏铁线莲育种课题组在品种耐热栽培适应性研究方面进行了多年实践,本次选取11项典型生理生化指标,采用主成分、隶属函数和逐步回归等分析方法,对20个常见铁线莲品种的耐热性进行比较,筛选出6个适宜的耐热性评价指标,并据此建立评价体系,旨在为铁线莲品种栽培适应性评价体系的建立和耐热型铁线莲品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的20个铁线莲栽培品种均为江浙地区广泛销售的种类。 采用由波兰 CLEMATIS Z'ródło Dobrych Pnᶏczy公司进口的3年生扦插苗,每个品种6株,共120株。试验开始前在国际铁线莲协会(International Clematis Society,http://www.clematisinternational.com)数据库中对所购买品种主要信息逐一进行核对(表1)。

1.2 试验方法

1.2.1 高温半致死温度测定 为避免自然高温对叶片的影响,于2015年5月14-16日(日最高温度26～27℃)采集叶样。选用健康、成熟叶片作为试验材料,每个品种采集3个植株,每株2～3片复叶。叶片高温半致死温度测定参照李谦盛等[6]的方法,采用Logistic方程进行拟合计算:

表1 20个供试铁线莲品种基本信息Table 1 The information of 20 Clematis cultivars

式中,y:叶片相对电导率；k:相对电导率的饱和容量；t:处理温度。方程经线性化处理后采用直线回归法计算a、b值。

1.2.2 高温处理与观测采样 2015年7月23日傍晚将供试植株放入温室,利用温室内加小棚(高1.5 m、底宽2.2 m、长16 m)的方式获取高温对试验材料进行处理。于7月24日、7月31日和8月7日分3次进行形态观测和叶片样品采集,形态观测包括每个品种的6个植株茎、叶生长情况并记录,叶片采集方法同1.2.1。试验期间进行正常水分管理,小棚内温度变化见图1。

1.2.3 高温下植株热害指数的测定 热害指数(heat injury indexes,HII)的量化参考杨寅桂[7]的方法,并稍加改进。根据叶片在高温下的表现,将热害分为:0级,植株长势旺盛,成熟叶片和新叶正常,无热害表现；1级,植株长势较好,新叶和成熟叶片发黄、下垂占比1/3以下；2级,植株长势一般,新叶和成熟叶片发黄、叶片边缘发黑、出现焦枯斑点、下垂占比1/2～2/3；3级,植株长势较差,新叶和成熟叶片发黄、叶片大面积焦枯、下垂占比2/3以上；4级,整个植株枯萎死亡。按照公式计算热害指数:

热害指数越大,植株受害越严重,耐热性越弱。

1.2.4 高温下叶片生理生化指标测定 叶片萎蔫程度(wilting degree,WD)的测定参照刘少卿等[8]的方法。分别在6:00～7:00和14:00～15:00期间采叶样并称取鲜重,再将叶片放入105℃烘箱,5 h后称叶片干重。分别计算早上和中午的叶片含水量,两者差值即可量化为叶片萎蔫程度。参照李合生[9]的方法分别测定相对电导率(relative electrical conductivity,REC)、叶绿素含量(chlorophyll content,CC)、可溶性蛋白含量(soluble protein content,SPC)、可溶性糖含量(soluble sugar content,SSC)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量；参照Zhu等[10]的方法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶(peroxidase,POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性。每个指标3次重复。

图1 试验期间气温变化Fig.1 The variation of temperature during the test

1.2.5 数据分析与耐热性评价 选取8月7日测定的数据用于铁线莲品种耐热性评价分析。采用Microsoft Office Excel 2007进行数据整理与作图；SPSS 19.0和DPS V7.05进行相关性、主成分、隶属函数[11]、逐步回归[12]和系统聚类分析。

2 结果与分析

2.1 不同铁线莲品种高温半致死温度

高温半致死温度(lethal temperature 50,LT50)是指在该温度下,植物达到半致死状态,若温度继续升高,植物所受的伤害将不可恢复甚至死亡。以Logistic Equation拟合计算不同品种的高温半致死温度,拟合度R2在0.889～0.934之间(表2),拟合效果理想。如古、罗曼蒂克和浪子的LT50均超过40℃,其中如古最高,达到42.17℃,表现出较强的高温适应性。苏珊夫人、维辛斯基主教、蓝焰和蓝光的LT50均在35℃以下,对高温的耐受能力较弱。

表2 不同样本高温半致死温度Table 2 The semi-lethal high temperature of different samples

2.2 热害指数观测

7月24日-8月7日均为晴热天气,外界日最高气温达39℃,温室小棚内最高气温达到41℃(图1),日平均最高和最低气温分别为38.4和27.2℃。试验期间最高气温超过37℃有12 d(80.0%),为铁线莲耐热指标观测创造了良好条件。持续高温对铁线莲茎叶长势影响显著,各品种的热害指数均有所升高(图2)。至8月7日,蓝光、蓝焰、水晶喷泉、苏珊夫人和小鸭等表现出叶片失绿、边缘卷曲、叶片萎蔫干枯等较严重的热害症状；罗曼蒂克、如古、浪子和里昂村庄等种类受害程度较轻,显示出较强的耐热能力。

2.3 高温下生理生化指标的变化

由图2可知,高温状态下,不同铁线莲品种的HII、WD、REC、SSC、MDA 含量,以及POD 和APX 活性均呈上升趋势；除苏珊夫人SOD活性略有反复外,其他品种SOD活性均呈上升趋势；CC和SPC随着热害时间的延长均呈下降趋势。总体而言,各单项指标中不同品种的测定值变化方向趋于一致,高温胁迫对铁线莲品种的生理代谢过程产生了显著影响,所选取的各项指标较为合理。此外,不同品种在同一指标内的变化幅度差异较大,以7月24日和8月7日的HII、WD和REC数据为例,罗曼蒂克、如古和浪子的HII增幅最小,均在1.0以下,蓝光、蓝焰和水晶喷泉增幅较大,都在2.0以上；罗曼蒂克和如古的WD增幅较小,均在0.35以下,蓝光和水晶喷泉的WD增幅较大,均高于0.81。罗曼蒂克、如古和浪子的 REC增幅均小于0.331,蓝焰、维辛斯基主教和水晶喷泉的REC增幅均大于0.90。对上述3项指标而言,数值增幅或绝对值越大均表明此种类耐热性越弱,反之则耐热性越强,但依据其中任意一项指标都将得到不同的耐热性评价结果,采用多指标的综合评价方法才能避免此类问题。

图2 高温下20个铁线莲品种的生理生化指标变化情况Fig.2 Changing of physiological and biochemical index of 20 Clematis cultivars under heatshock

2.4 耐热性评价

2.4.1 各生理生化指标的相关性分析 由表3可知,HII、WD、MDA含量以及 SOD、POD活性与 REC呈正相关,CC、SPC、SSC以及APX活性与REC呈负相关,其中SPC、MDA含量和SOD活性与REC的相关性均达到极显著或显著水平。各指标之间的相关性会使它们提供的信息产生不同程度的重叠,需要进一步分析,以明确不同指标在铁线莲耐热性中的贡献率,构建综合评价体系,并据此筛选耐热性评价的关键指标。

表3 10个生理生化指标相关性分析Table 3 Correlation analysis of 10 physiological biochemical indices

2.4.2 耐热性评价 主成分分析可以通过降维的方法精简指标数量,将多个相互关联的指标转化为少数几个包含原有变量绝大多数信息,且互不干扰的综合指标。由表4可知,原有10个生理生化指标可简化为累计贡献率85.513%的4个综合指标,其特征值分别为4.735、1.551、1.150 和 1.115；贡献 率 分别为47.353%、15.510%、11.504%和 11.146%。4个综合指标能够反映原有10项指标的绝大部分信息,便于更准确地评价不同铁线莲品种的耐热性强弱。

表4 高温胁迫下不同铁线莲种类生理生化指标主成分分析结果Table 4 Result of principal component analysis of physiological-biochemical indexes of different species in Clematis under high temperature stress

以4个主因子综合指标值(comprehensive index,CI)为基础数据,利用隶属函数公式进行标准化转换得到其隶属函数值(subordinate function value,U)(表5),根据4个主成分的贡献率和累积贡献率,可以计算出其综合指标权重,分别为0.505、0.270、0.125和0.100。依据综合指标的隶属函数值和权重,计算得出20个铁线莲品种的耐热性综合评价值(comprehensive evaluation value,D)。得分越高者耐热能力越强,反之耐热能力越弱。因此,20个铁线莲品种的耐热性由强到弱依次为罗曼蒂克＞如古＞浪子＞乌托邦＞里昂村庄＞戴安娜公主＞总统＞灵感＞包查德女伯爵＞苏珊夫人＞如梦＞东方晨曲＞狂想曲＞小鸭＞蓝天使＞茱莉亚夫人＞维辛斯基主教＞水晶喷泉＞蓝焰＞蓝光。

2.4.3 耐热性聚类分析 以8月7日数据分析结果为依据进行聚类分析,可以将20个铁线莲品种分为4组(图3-C)。由表5可知,第一组为耐高温型,包括罗曼蒂克、如古和浪子共3种(15.0%)；第二组为较耐高温型,包括乌托邦、里昂村庄、戴安娜公主、总统、灵感、包查德女伯爵、苏珊夫人、如梦、东方晨曲、狂想曲、小鸭和蓝天使共12种(60.0%)；第三组为高温较敏感型,包括水晶喷泉、维辛斯基主教和茱莉亚夫人3种(15.0%)；第四组为高温敏感型,包括蓝焰和蓝光2种(10.0%)。将基于7月24和31日数据计算所得综合评价值D各自进行聚类,所得结果存在一定差异(图3-A、B)。随着高温胁迫时间的延长,耐高温型(Ⅳ)与高温敏感型种类(Ⅰ)的热适应性差异逐步显现,从群体中(图3-A)分离出来。8月7日与7月31日的聚类结果中耐高温型与高温敏感型种类保持一致,高温较敏感型(Ⅱ)与较耐高温型(Ⅲ)品种的D值排序仍有小幅变动(图3-B、C),表明自然高温处理条件下,供试铁线莲品种间的耐热能力差异必须经历一定时间(1～2周)的持续胁迫才能显现,这与耐热指标随时间的显著性改变(图2)相互呼应。

表5 20个铁线莲品种综合指标值、隶属函数值及综合评价值Table 5 The values of CI,U and D of 20 Clematis cultivars

图3 依据高温下3次采样数据的耐热综合评价值进行聚类分析。Fig.3 Cluster analysis based on the comprehensive evaluation value of three sampling data under high temperature stress

2.4.4 耐热鉴定指标筛选 本试验涉及的耐热评价单项指标较多,通过逐步回归分析可以在保证耐热评价准确度的前提下精简评价指标,从而减少工作量,建立准确、高效的铁线莲品种耐热评价体系。以耐热综合评价值D为因变量,各单项指标数据作为自变量,进行逐步回归分析,建立如下回归方程:

y=-0.007 2+0.015 1x1+0.008 5x2-0.178 9x4+0.003 2x7+0.032 6x8-0.005 1x10(F=136.450,R=0.989,P=0.000 1)。

原有10个单项评价指标可以精简为x1、x2、x4、x7、x8和x106项,它们分别代表了相对电导率、热害指数、叶绿素、MDA含量、SOD活性和APX活性。此外,将耐热综合评价值D与高温半致死温度LT50进行相关性分析,发现两者呈极显著正相关(R=0.83**),即LT50也可以作为铁线莲耐热性评价的指标。

3 讨论

3.1 铁线莲品种的耐热性及其与高温半致死温度指标的关系

植物原产地气候条件对其生态适应性影响很大。本研究所选用的20个品种中有16个(80%)源自英国、法国、波兰等气候冷凉的欧洲国家,这些品种在耐寒、耐旱性方面都有不错的表现,但高温耐受性是其适应能力的短板[13]。本次筛选出的耐热种类仅有罗曼蒂克、如古和浪子3种(15.0%),也印证了这一观点。研究表明,植物细胞膜稳定性与其抗逆性密切相关,以电导率拟合Logisitic方程可以简单、准确地估算高温半致死温度,也能较准确地反映植物耐热性差异[14]。这种高/低温半致死温度与植物抗逆能力的相关性同样出现在生菜(Lactuca sativa)[15]、景天属(Sedum)植物[16]的耐热和葡萄(Vitis vinifer)[17]、油橄榄(Olea europaea)[18]等植物的耐寒性研究结论中。但也有学者认为,离体测定植物叶片细胞的电导率并不能真实反映植株受害程度[19]。本研究中,铁线莲供试样本耐热综合评价结果与高温半致死温度呈极显著正相关,验证了其作为铁线莲耐热评价指标的可靠性,值得注意的是,在杜鹃(Rhododendron simsii)[20]、金花茶(Camellia nitidissima)[21]、黄瓜(Cucumis sativus)[22]等植物中,耐热类型的LT50都在50.0℃以上,本次筛选出的3个耐热型铁线莲品种中LT50最高为42.17℃(如古),这与五叶地锦、凌霄等常见观赏藤本植物60℃以上的LT50[23]相比,耐热能力差距明显。这一方面反映了不同植物间的耐热性差异,另一方面表明供试铁线莲品种耐热能力总体水平较低。

3.2 高温对铁线莲形态和生理生化指标的影响

持续高温会造成耐热性较差的铁线莲品种叶片变黄、萎蔫下垂,这是叶绿素降解、叶片细胞失水的表现[24-25]。HII可以直观反映植物遭受热害的程度,并将其表型特征数量化,便于进行数据分析,被认为是比较可靠的耐热性评价指标并广泛应用[26-28]。本研究结果表明,不同耐热型铁线莲品种的HII差异显著,可作为耐热性评价的关键指标,也验证了HII的可靠性,为通过表型观测对品种耐热性进行预判提供了依据。

此外,本研究中入选的铁线莲耐热性评价关键生理指标还有 REC、MDA含量、CC以及 SOD、APX活性,由于测定样本数量、选取指标类别和数据分析方法存在差异,导致与朱玉雪等[2]在4种铁线莲耐热性研究中筛选出的REC、MDA含量、相对含水量和CAT活性4个指标并不完全一致,但REC和MDA含量均入选关键评价指标。REC和MDA含量是评价植物抗逆性的传统指标,已被用于铁炮百合(Lilium longiflorum)[29]、菊花(Chrysanthemum morifolium)[30]、蓝莓(Vaccinium corymbosum)[31]、越桔(Vaccinium corymbosum)[32]等诸多园艺植物的耐热性评价。叶绿素含量与植物光合机能关系密切,易受到热胁迫的影响[33]。研究表明,叶绿素含量下降是造成光合速率下降的根本原因,其含量变化可以在一定程度上反映植物受害程度[34]。本研究中,耐热性越弱的铁线莲品种,其叶绿素含量降低越显著,与黄瓜(C.sativus)[35]、苏铁(Cycas revoluta)[36]的研究结果相似。此外,高温等逆境条件会使植物细胞内产生大量超氧自由基(),造成细胞膜脂过氧化胁迫。抗氧化酶系统可以清除细胞内过度积累的活性氧等有毒物质,维持细胞膜正常的生理功能。APX以抗坏血酸为电子供体,可以有针对性地清除叶绿体细胞内的H2O2和；SOD是参与清除活性氧系列反应中的第一个抗氧化酶,能将快速歧化为O2和H2O2,再由POD和CAT负责清除,从而保护细胞免受氧化胁迫[38]。高温引起铁线莲品种APX、SOD和POD等抗氧化保护酶活性提高,其中SOD和APX活性变化与品种耐热能力具有显著相关性,表明这2种保护酶在铁线莲热胁迫响应和耐热性状形成过程中发挥着重要作用,但POD活性与铁线莲品种耐热性并未表现出明显的对应关系,其原因有待于进一步研究。

3.3 耐热性评价的复杂性

不同植物种类对热胁迫的响应与适应机制存在较大差异。植物的耐热性与自身表型性状、发育阶段[39-40]、生理代谢强弱等有关,又受热害发生时间、持续时间、胁迫强度、光照、水分因子的共同作用等多种因素影响,是在植物与环境因子之间相互作用的复杂过程中形成的[41-42]。本研究利用温室内的自然高温进行热胁迫处理,有效控制了夏季强光、高湿等复合逆境的形成,利于更加客观地对铁线莲品种耐热性进行评价。可用于耐热性评价的指标种类丰富[43],对热胁迫的响应方式各异,不同指标之间也存在一定关联[44]。本研究中,10个生理生化指标在高温下的变化趋势和相关性分析结果与上述观点一致,表明使用单项指标难以对铁线莲品种耐热性进行准确评判,借助多元统计方法才能构建高效、准确的铁线莲耐热评价体系。

4 结论

本研究结果表明,按照耐热性排序,20个铁线莲品种可划分为耐高温、较耐高温、高温较敏感和高温敏感4种类型；REC、HII、CC、MDA 含量和 APX 活性 6个指标可以反映铁线莲的耐热能力,由其建立的方程模型可以高效、准确地进行铁线莲耐热性评价,依据综合评价值D证实了半致死温度作为铁线莲耐热性评价的可靠性。本研究为铁线莲栽培适应性评价体系的建立和耐热型品种选育提供了理论基础和实践依据。