多柔比星纳米递药系统在三阴性乳腺癌靶向治疗中的应用

张敏娜，钟 鸣，王光辉

(济宁医学院药学院，山东 日照 276826)

高度恶性肿瘤三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)的生物学特点是肿瘤细胞雌激素受体(estrogen receptor,ER)阴性、孕激素受体(progesterone receptor,PR)阴性和人类表皮生长因素受体2(human epidemal growth factor receptor 2,HER2)阴性，肿瘤细胞的增殖不依赖于ER、PR和HER2，缺乏明确的药物靶点，常规途径给药化疗难以奏效，且不良反应严重[1]。多柔比星(Doxorubicin，Dox)通过干扰肿瘤细胞mRNA 和DNA的合成抑制肿瘤增殖。该药对S期和M期肿瘤细胞作用尤为突出，属广谱周期非特异性抗肿瘤药物(对乳腺癌、急性白血病、肉瘤、恶性淋巴瘤、肺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤均有作用)，在治疗恶性肿瘤同时对正常组织细胞选择性低，细胞毒性以造血系统毒性(骨髓抑制)和心脏毒性(心律失常、心肌损伤、心力衰竭等)最为突出。近年来研究发现，纳米递药系统显著改变化疗药物体内生物学特性[2]，尤其降低药物的细胞毒性方面具有明显优势[3]。本文就近年来Dox纳米递药系统在TNBC治疗中的应用进行介绍，为TNBC治疗提供参考。

1 纳米材料独特的生物学特性及在肿瘤诊断和治疗中的应用

1976年Birrenbach等人首先提出了纳米粒和纳米囊的概念，1977年Couvreur等人发现纳米颗粒能够进入细胞，并具有溶酶体趋向性。1978年Kreuter等人用纳米颗粒进行了疫苗载体的研究，1979年Couvreur等人用纳米材料进行抗癌药物载体的研究，90年代纳米技术研究已成为医药领域的研究热点之一。纳米材料在医学领域中应用包括生物荧光标记、病原体检测、细胞及生物分子的分离纯化、磁共振成像、靶向药物/基因传输、肿瘤诊断和治疗等方面[4]。纳米材料主要通过其特有的粒径效应(直径在1～100 nm范围)、表面效应(拉曼光谱散射)、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应介导的超强吸附能力、化学反应能力、分散与团聚能力等发挥作用[5]。

具备靶向药物/基因传输功能的纳米递药系统应用广泛，发展较为迅速，早期的纳米递药系统结构简单，通常以脂质体为载体，携带药物进入体内，可减少被单核细胞吞噬清除的机会，药动学监测显示药物在体内半衰期延长，药效随之增强。随着纳米递药系统研究的深入，纳米材料参与靶向给药方面取得了很大的成效，可实现负载药物后到达病区进行集中释放。近年来随着纳米技术的不断发展和完善，纳米载体携带药物能有效克服细胞内环境屏障(如肿瘤病灶周围的酸性环境屏障)、病灶区域渗透压屏障等顺利到达靶组织/靶细胞，实现药物缓控释放，增加了药物的疗效，减少了药物的不良反应。纳米技术引领药物的递送向智能化和可视化方向发展，实现了集紫外光激发光热效应、磁力效应、化学效应与一体的药物治疗新策略，实现了智能化给药和实时监测，为医药研究的新领域[6,7 ]。

近年来，在肿瘤治疗方面，纳米材料具有较好的组织相容性，通过肿瘤细胞过表达的分子，精准识别肿瘤组织，增加肿瘤细胞对化疗药物的摄取，激发光导热消融作用杀死肿瘤细胞，有效遏制肿瘤的转移和复发。纳米材料表面的离子体共振波长可以随长宽比变化，实现了从可见光区域到近红外区域连续可调，形成极高的表面电场强度增强效应，极大的光学吸收和散射截面，用于肿瘤诊断、成像、精准治疗和实时治疗监测[8,9]。

2 多柔比星纳米递药系统在TNBC中的应用

2.1 基于肿瘤酸性微环境的多柔比星体Dox纳米递药系统肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME) 由肿瘤细胞外基质和酸性pH值、乏氧、间质液体压力等因素组成，与肿瘤的增殖、分化和迁移密切相关。酸性微环境的形成源于缺氧条件下的肿瘤组织的无氧代谢，缺氧环境激活糖酵解，通过一系列产生酸的级联生化反应形成[10]。pH 值敏感型纳米递药系统通过pH 值敏感化学键(腙键、缩醛键、酯键、酰胺键、肟键等化学键)连接Dox，肿瘤酸性微环境中此键断裂断裂，释放药物，因此肿瘤组织药物浓度高于正常组织。这种药物传递系统显著改变药物的体内生物学特性，尤其在降低药物的细胞毒性方面具有明显优势，增效减毒作用的发挥依赖于恶性肿瘤形成的酸性微环境，成为抗肿瘤治疗的重要研究方向。

TME中酸性pH值和水解酶(蛋白)的过表达，为Dox靶向纳米递药系统提供发挥作用的条件。基于pH反应的生物降解多聚谷氨酸(poly glutamic acid，PGA)的Dox纳米递药系统Dox-PGA，PGA为 pH敏感性连接物，酸性环境促进了纳米载体聚合物主链的特异性释放Dox。TNBC小鼠模型经静脉系统Dox-PGA给药发现低剂量的Dox对原发肿瘤生长和肺转移(降低90%)产生了明显的抑制效果[11]。Dox-PGA递药系统可增加肿瘤细胞对Dox摄取，最大限度的减少正常细胞对Dox的摄取，保护正常组织。纳米蛋白交联聚合物笼(cross-linked polymer cage，CLPC)一方面借助肿瘤酸性微环境促发链接Dox的pH值敏感的腙键断裂，在肿瘤局部释放药物形成高浓度Dox，进而发挥Dox的抑制和杀灭肿瘤效应；另一方面阻止正常细胞(pH约为7.40)对Dox摄取。更有意义的是CLPC进一步通过改变聚合物笼中交联的程度调整纳米载体表面电位，进而实现调控Dox纳米载体的体内循环时间。动物模型实验证实TNBC荷瘤小鼠对其耐受性良好， Dox血浆半衰期延长，内脏器官蓄积减少，细胞的毒性降低[12]。

酸性肿瘤微环境及过表达特定的酶蛋白(水解酶)、温度和pH值构成了Dox释放调节体系。鱼精蛋白中螺旋/α-螺旋构象的改变以及蛋白质的酶解在酸性环境和温度的配合下可有效的调控表面电荷转化，增加肿瘤细胞对Dox的摄取量。鱼精蛋白-PAA-b-PNIPAAm纳米凝胶载体，对温度、pH和酶等变化因素敏感，其作用机制与酶蛋白的构象调节有关。当pH由7.4下调到5.0过程中，通过酶蛋白的构象调节引起表面电荷转化逐渐增强， TNBC MCF-7细胞株对Dox摄取明显增加[13]。另外纳米粒子可改变某些蛋白酶活性：将胶原酶I固定于纳米颗粒(nanoparticles，NPs)表面，胶原酶酶活性明显提高,有助于Dox穿越组织。 Amoozgar等[14]实验证实NPs表面涂覆胶原酶I后降解肿瘤组织胶原蛋白能力增强，Dox的药物穿透能力进一步增加；NPs蛋白质涂层降低了Dox的释放速率，从而能够持续缓慢释放Dox，延长药物作用时间，提高药效。

2.2 组织相容性生物活性增加的多柔比星体Dox纳米递药系统间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和纳米磁性混合颗粒LDGI(LDGI由脂质体、Dox、金纳米棒和氧化铁纳米团簇构成)构成的综合性纳米药物递送体系集合光声成像、靶向热疗和药物化疗与一体，其最为突出的特点是LDGI具有良好的组织相容性，可有效地吸收到MSCs中，维持细胞功能。此外，LDGI中氧化铁纳米颗粒使MSCs表达趋化因子受体CXCR4上调，进一步易化与TNBC肿瘤细胞的识别,提高了肿瘤治疗的靶向性。释放的Dox进入细胞核增多，有效阻断肿瘤DNA合成，且促进细胞凋亡。Xu等[15]体内实验结果显示，与单纯LDGI相比，MSCs-LDGI通过肿瘤内注射和静脉注射两种途径均能增强Dox在肿瘤组织分散能力和穿透肿瘤细胞的能力。纳米递药系统与细胞膜之间的组织相容性还取决于肿瘤局部形成的渗透压和药物本身在肿瘤酸性微环境中是否带有电荷等因素的影响，Dox作为一种可电离的弱碱药物，正常情况下以不带电的形式自由地渗透细胞膜，然而，在酸性TME中，Dox表面形成电荷，静电斥力作用下跨膜过程受阻，由此克服静电斥力构成的电荷屏障增加细胞相容性成为TNBC治疗研究的另一个方向。Abumanhal等[16]应用静脉注射碳酸氢盐-脂质体-Dox对TNBC动物模型治疗结果显示，给药在24 h后在肿瘤组织中检测到的脂质体的含量为3.7%±0.3%，与注射游离非脂质体碳酸氢盐的对照组(肿瘤组织的脂质体含量0.17%±0.04%)相比，肿瘤组织的脂质体含量提高了21倍。进一步检测结果显示，肿瘤内pH值达到7.38±0.04。以上研究结果证实碳酸氢盐-脂质体-Dox给药体系对TNBC的治疗效果优于单纯Dox给药和碳酸氢盐-Dox给药。对TME的进一步分析发现碳酸氢盐-脂质体-Dox给药体系治疗过程中T淋巴细胞、B淋巴细胞和巨噬细胞数量均增加，有效增强免疫系统对肿瘤的识别和应答能力。

Dox负载能力的提高对肿瘤细胞的抑制和杀灭具有决定性的意义。由近红外荧光染料菁5.5(CY5.5)和细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)抗体硫醚桥联的周期性介孔有机二氧化硅纳米粒(periodic mesoporous organosilica，PMO)构成的Dox靶向递药系统PMO-CY5.5-ICAM具有良好生物组织相容性，Dox负载能力提高至400 mg·g-1，共聚焦显微镜显示，Dox能有效靶向进入肿瘤细胞，导致肿瘤细胞死亡；体内实验进一步证实Dox在TNBC移植肿瘤组织中累积量大于对照组，有效遏制肿瘤增殖[17]。

靶向纳米递药系统增加组织相容性尚需突破其他的限制如药物靶向分布、细胞内化速度、溶酶体逃逸受限和肿瘤耐药性等因素。Alimoradi等[18]通过实验研究聚苯乙烯马来酸-叔十二烷S-亚硝基硫醇SMA-TDODSNO和 Dox联合应用对TNBC肿瘤细胞增殖活力、细胞凋亡、线粒体膜电位、溶酶体膜通透性和肿瘤体积变化的影响。结果SMA-TDODSNO-Dox协同降低TNBC 4T1细胞株的细胞活力并诱导细胞凋亡。4T1细胞与SMA-TDODSNO-Dox(40 μmol·L-1)共孵育后，细胞吸收显著增强，Dox浓度增加了2倍。SMA-TDODSNO单独给药可使肿瘤体积减少为单纯Dox组的2倍；SMA-TDODSNO-Dox联合应用可使肿瘤体积显著减少为Dox组的4.7倍，实验动物未见可监测的以体重减轻为标志的细胞毒性。

2.3 以肿瘤过表达的分子为靶点的纳米递药系统尽管TNBC表达低或缺乏雌激素、孕酮或Her2/Neu受体，TNBC癌细胞由于生长、转移或肿瘤耐药性的需要，往往过表达一些分子，可作为肿瘤标志物进行检测，为肿瘤诊断提供有价值参考信息。更重要的是这些分子中，上皮细胞粘附/激活分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)、CD44受体分子、叶酸受体α(folate receptor α,FRα)、转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR)等，可作为纳米递药系统识别、穿越肿瘤细胞的重要靶分子。由靶向EpCAM的银包覆金纳米棒(AuNR/Ag)和负载Dox组成的靶向纳米递药系统能够特异性靶向EpCAM高表达的肿瘤。该系统对MDA-MB-231细胞的有效剂量(ED50)为3 μmol·L-1，对4T1细胞有效剂量(ED50)为110 μmol·L-1。电感耦合等离子体质谱分析结果显示表达EpCAM的TNBC肿瘤细胞对Dox摄取速率增加[19]。

CD44受体在前列腺癌、胶质瘤和乳腺癌等多种肿瘤中表达增加，过度表达CD44受体的肿瘤往往预后不良。并且，CD44过表达已在许多不同的癌症干细胞(cancer stem cells，CSCs)中被发现，它们存在于许多实体肿瘤中，并促进生长、复发和对传统疗法的耐药性。TNBC中CSCs与肿瘤预后差、早期复发有关，这是因为CSCs具有较高的耐药性和肿瘤异质性，是抗癌治疗的主要靶点。包裹金NPs(AuNPs)聚合纳米复合物(polymer nanocomposite，PNC)是由不稳定的酸腙键与硫代透明质酸偶联的Dox和硫代聚乙二醇DNA CD44适配体共同组成的递药系统。研究发现，CD44阳性的TNBC细胞和CD44阴性TNBC细胞中相比，PNC的摄取量增加1倍，抑制肿瘤细胞增殖效果更明显，肿瘤细胞更新能力下降，且 Dox的效能提高，非靶组织毒性有所减少[20]。

化疗是乳腺癌治疗的主要策略，缺乏特异性和化疗药物不良反应的高负担仍然是乳腺癌患者成功治疗的最重要障碍。高亲和力FR跨膜转运叶酸至细胞内部， 根据构成FR的糖多肽的不同分为四种亚型：FRα、FRβ、FRγ和FRδ。FRα为叶酸结合蛋白，以高亲和力结合并将活性形式的叶酸单向转运到细胞。FRα在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和垂体腺瘤等肿瘤中高表达，与恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移相关。β-乳球蛋白纳米颗粒BNPs共轭叶酸和Dox构成递药系统FD-BNPs粒径为(109.77±2.80) nm，具有良好的分散性和穿透细胞膜能力。包封率为68.82%±1.76%的FD-BNPs对乳腺癌细胞株(MCF-7和MDA-MB-231)的生长抑制作用和诱导细胞凋亡作用显著。基于这些发现，FD-BNPs具有促进药物释放和靶向Dox递送能力，对乳腺癌和TNBC具有较高的治疗潜力[21]。

利用叶酸和/或转铁蛋白(transferring ，TF)对纳米材料进行功能化，使药物靶向传递更加精准有效，因为癌细胞过表达叶酸和TFR，可以介导携带药物的纳米递药系统的内吞作用。对金纳米粒AuNPs经叶酸/TF配体修饰后的药物载体，能够更加精准靶向控制药物的释放，减少药物的副作用，提高药物的疗效。Santiago 等[22]在实验中将Dox加载到叶酸/TF配体修饰后的药物载体，用超灵敏的表面增强拉曼散射光谱来监测跟踪其受激释放情况。研究结果证实AuNPs经叶酸/TF配体修饰后的药物载体在不损伤正常细胞的前提下，对靶向癌细胞实现Dox高剂量给药，同时实现了肿瘤治疗的影像学监测。

3 总结与展望

综上所述，多柔比星纳米递药系统作为近年来TNBC治疗的新策略，其优势包括：(1)多柔比星纳米递药系统在肿瘤酸性微环境中，实现了Dox缓释效应和对肿瘤细胞的持续作用。(2)多柔比星纳米递药系统组织相容性增加，一方面肿瘤细胞摄入Dox增加，加强化疗药物疗效，另一方面正常细胞吸收减少，明显减轻药物的骨髓抑制和心脏毒性等细胞毒性不良反应。(3)纳米材料所独有的紫外线激发光热效应杀灭各个时期肿瘤细胞、肿瘤干细胞和耐药肿瘤细胞。(4)纳米递药系统同时实现了免疫系统的激活和肿瘤治疗的可视化监测。

当前纳米递药系统存在的问题主要集中在纳米材料的材质引发的组织器官的毒性反应，主要包括纳米材料对线粒体、游离核糖体、粗面内质网、过氧化物酶体和细胞核等重要细胞器结构损伤和功能的抑制[23]。如纳米银颗粒在体内产生大量自由基导致组织和器官的氧化应激损伤[24]，进入肝细胞引发肝药酶代谢活力降低导致代谢障碍，干扰转录因子NF-E2相关因子2所致的蛋白酶表达异常等[25]。除此之外，纳米的组织特异性、对递送条件的控制、载体的大小、生物分布率的限制等因素也会影响携带药物药效的发挥。随着纳米技术构筑的载体不断完善，未来的纳米递药系统结构上将会是集合高效性、低毒性和精准靶向性于一体，功能上实现纳米载体同时携带化疗药物、肿瘤增殖抑制基因片段和免疫增强剂等综合疗法于一体，实现智能化给药，通过多途径、多靶点抑制和杀灭肿瘤细胞，为TNBC治疗和研究带来新的契机。