针刺疗法对帕金森病大鼠黑质神经元凋亡蛋白bcl-2、bax的影响*

吴成举，英锡相，陈 靖，谢 鑫，刘文俊，张小卿，吴景东，马铁明，马贤德

辽宁中医药大学(沈阳 110847)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见的中老年神经系统变性疾病，以运动迟缓、静止性震颤、姿势步态异常和肌强直[1]为临床主要特征。纹状体多巴胺(DA)含量下降、中脑黑质 DA 能神经元逐渐变性死亡为主要病理改变。在我国65岁以上人群患病率为2.05%。人类平均寿命的延长和社会老龄化的到来，发病率呈明显上升趋势，已经成为影响人类身体健康和生活质量的重要疾病。

针灸在临床治疗PD的应用中疗效可靠、无毒副作用、并且可以减少多巴胺毒副反应和用药量，极大的体现了针灸治疗PD的优势和特点[2]。本实验研究通过观察不同方法针灸对PD模型大鼠脑细胞神经元代谢的影响，可以提高PD大鼠黑质多巴胺能神经元合成多巴胺的功能,改善大鼠的行为学，各针刺组可上调bcl-2表达，抑制bax表达，为针灸治疗PD提供了理论支持。

材料和方法

1 实验动物与分组 SPF级雄性大鼠60只(Wistar)，体重(250±50) g，辽宁长生生物技术有限公司提供。大鼠购入后饲养于辽宁中医药大学实验动物中心SPF级动物饲养室内，适应性饲养1周后开始正式实验。

将60只大鼠按照随机数字表法随机分为5组(每组12只)，空白对照组、模型对照组(帕金森动物模型)、电针组(帕金森动物模型+电针治疗)、头针组(帕金森动物模型+头针治疗)、电针+头针组(帕金森动物模型+电针+头针治疗)。

2 主要试剂与仪器 鱼藤酮(SigmaAldrich，cas:83-79-4)；anti-bax(abcam，货号：ab53154)；anti-bcl-2(abcam，货号：ab196495)；SP试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，编号：KIT-0105R)；DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，编号：DAB-0031)；TUNEL试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，目录号：KGA7073)；乌拉坦、戊二醛等化学试剂购于国药集团化学试剂沈阳有限公司。

华佗牌针灸针：贵州安迪药械有限公司；G6805-2型电针治疗仪： 示波器照相机(日本)、SW-CJ-IF净化工作台(国产)、CK-2倒置显微镜(日本，OLYMPUS)； PROTEANTMⅡ聚丙烯凝胶电泳(美国，LTI)、凝胶成像分析系统(上海天能)；XE380超低温冰箱(法国)；KOHTRON高速低温离心机(瑞典)；DU640核酸蛋白分析仪(美国)；Bio-Rad550型酶标仪(美国)；BT-31恒温水浴振荡仪(日本， KAMAMOTO)、PCS-SP2激光共聚焦显微镜(德国，Leica公司)。

3 模型建立 除空白对照组外，其余大鼠皮下注射鱼藤酮(油溶液配成1.5 mg/ml)，1.5 mg/(kg·d),持续给药3周,按照所建立的模型神经行为学记分标准记分，如果达到相应记分后就停止给药。

帕金森大鼠行为学记分标准：在1周末、2周末及3周末分别观察鱼藤酮1周、2周及3周的所有大鼠的行为学变化并对其进行mNSS评分，将结果与两个对照组比较；应用mNSS评分表可综合评价大鼠的运动、感觉、反射和平衡功能的改变，其总分为18分，0分为没有任何伤害，1～6分为轻度损害，7～12分为中度损害，13～18分为重度损害。mNSS评分1～18分的大鼠均纳入帕金森模型进行实验。

4 治疗方法 针灸处理方法：以养血祛风、镇静安神为治疗原则。按照全国针灸学会实验针灸研究会制定的《实验动物针灸穴位图谱》取穴。

电针组处方：采用王彦春近年来提出的“双固一通” 法，关元、足三里、太冲、风府。头针处方：舞蹈震颤控制区、运动区、足运感区。 采用“华佗牌”38号针灸针(0.18 mm×25 mm)，电针组接6805-D型电针仪，施以疏密波，疏波频率2 Hz，密波频率6 Hz,强度2～4 mA，留针20 min；头针组进针时针身与头皮呈30°，在帽状腱膜下将针身进到2/3后快速平稳捻针，每隔5～10 min 行针1次，留针20 min。所有治疗组于造模成功后每日治疗1次，7次为1个疗程，共治疗3个疗程，疗程间休息1 d。

5 观察指标

5.1 鱼藤酮致帕金森大鼠行为学记分：末次针刺后，对各组大鼠进行行为学评分，按照“材料与方法中模型建立”行为学记分标准评分，然后进行统计分析。

5.2 HPLC法测定黑质纹状体中DA含量：末次针刺后1 h，各组大鼠随机抽取6只，过量麻醉处死，立即置于冰台上，迅速分离出纹状体脑组织，称重，作为实验样品将其低温保存。制备组织匀浆，加入正丁醇2.0 ml，混和均匀，在4℃下，离心15 min(10000 r/min)。抽取上清液，加入正庚烷2.0 ml、0.50 ml(0.1 mol/L HClO4)、进行3 min旋涡振荡，然后低速离心3 min(3000 r/min)。将有机相除去，加2.0 ml CHCl3在下层的水相中，经过3 min旋涡振荡、3 min低速离心后，直接进样上层水样。进样量为20 μl。缓冲液作为流动相(磷酸氢二钠0.05 mol/L和柠檬酸三钠0.02 mol/L)∶甲醇溶液=90∶10，经滤膜(0.45 μm)过滤并且超声脱气后使用。

5.3 TUNEL法检测细胞凋亡：末次针刺后1 h，各组剩余的6只大鼠，采用10%水合氯醛麻醉,开胸行主动脉插管,剪开右心房,以100 ml生理盐水经升主动脉快速冲洗,随后灌注(4℃)冷的400 ml，包含0.1 mol/L戊二醛(0.05%)、多聚甲醛(4%)、pH 7.4磷酸缓冲液,开颅取中脑,在不含戊二醛的上述灌注液中固定过夜(4℃),注入25%蔗糖促使组织块沉底。连续冠状切片,使用冷冻切片机，切片厚40 μm，涂有多聚赖氨酸的载玻片捞片。采用原位末端标记染色(TUNEL)法检测各组大鼠脑组织中细胞凋亡情况。常规制备石蜡切片，并采用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱二甲苯至水。然后将组织薄膜以免疫组化笔圈涂，于圈内滴加50 μl TdT酶反应液(TdT酶反应液：45 μl Equilibration Buffer+1 μl FITC-12-Dutp+4 μl TdT Enzyme，需新鲜配制)(阴性对照片不加TdT酶)， 37摄氏度避光湿润反应60 min，PBS漂洗三次，防荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察，每张切片选取5个随机视野，计数每个视野中的阳性细胞数，并以平均值作为该例大鼠脑组织细胞凋亡数，进行统计分析。

5.4 免疫组化法检测bcl-2、bax蛋白表达：切片制备同 “TUNEL法检测细胞凋亡”中的步骤，然后采用SP法进行免疫组织化学染色，检测bax、bcl-2表达水平测定。常规制备石蜡切片，并采用二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱二甲苯至水。然后将组织薄膜以免疫组化笔圈涂，于圈内滴加bax/bcl-2一抗工作液，bax一抗稀释比为1∶300；bcl-2一抗稀释比为1∶500，4℃孵育过夜，次日取出后，PBS缓冲液洗片3次，滴加HRP标记的羊抗兔二抗(1∶1000)，室温孵育2 h，PBS缓冲液洗片3次，DAB显示10 min，苏木素复染1 min，1% 盐酸乙醇分化后，中性树胶封片，数码显微镜下观察，选取染色良好区域，测定5个随机视野的平均光密度值，取其平均值作为该例大鼠脑组织中目的蛋白的相对表达水平进行统计分析。

6 统计学方法 结果采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，三组及以上组间比较采用单因素方差分析，两组组间比较采用t检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 鱼藤酮致帕金森大鼠行为学记分 行为学评分结果显示：与空白对照组比较，模型对照组大鼠行为学评分显著升高(P<0.01)，有统计学意义；与模型对照组比较，头针组、电针组、头针+电针组大鼠行为学评分显著降低(P<0.01)，有统计学意义；与头针组比较，头针+电针组大鼠行为学评分显著降低(P<0.05)，有统计学意义；与电针组比较，头针+电针组大鼠行为学评分显著降低(P<0.05)，有统计学意义。见表1。

2 各组大鼠黑质纹状体中多巴胺含量、脑组织细胞凋亡检测、黑质中bax、bcl-2表达

2.1 各组大鼠脑黑质纹状体组织中DA含量测定结果显示：与空白对照组比较，模型对照组大鼠黑质纹状体脑组中DA含量显著降低(P<0.01)，有统计学意义；与模型对照组比较，头针组、电针组、头针+电针组大鼠黑质纹状体脑组中DA含量显著升高(P<0.01)，有统计学意义；与头针组比较，头针+电针组大鼠黑质纹状体脑组中DA含量显著升高(P<0.01)，有统计学意义；与电针组比较，头针+电针组大鼠黑质纹状体脑组中DA含量显著升高(P<0.01)，有统计学意义。见表2。

2.2 TUNEL法检测细胞凋亡：与空白对照组比较，模型对照组大鼠脑组织中细胞凋亡数显著增加(P<0.01)，有统计学意义；与模型对照组比较，头针组、电针组、头针+电针组大鼠脑组织中细胞凋亡数显著减少(P<0.01)，有统计学意义；与头针组比较，头针+电针组大鼠大鼠脑组织中细胞凋亡数显著减少(P<0.01)，有统计学意义；与电针组比较，头针+电针组大鼠脑组织中细胞凋亡数显著减少(P<0.01)，有统计学意义。见表2。

2.3 脑组织中bcl-2、bax蛋白表达水平：各组大鼠脑组织中bcl-2、bax蛋白表达水平测定结果显示：与空白对照组比较，模型对照组大鼠脑组中bax表达水平显著升高(P<0.01)，而bcl-2表达水平显著降低(P<0.01)，差异有统计学意义；与模型对照组比较，头针组、电针组、头针+电针组大鼠脑组中bax表达水平显著降低(P<0.01)，而bcl-2表达水平显著升高(P<0.01)，有统计学意义；与头针组比较，头针+电针组大鼠脑组中bax表达水平显著降低(P<0.01)，而bcl-2表达水平显著升高(P<0.01)，有统计学意义；与电针组比较，头针+电针组大鼠脑组中bax表达水平显著降低(P<0.01)，bcl-2表达水平显著升高(P<0.01)。见表2。

表1 各组大鼠mNSS评分比较(分)

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.01；与头针组比较，△P<0.01；与电针组比较，☆P<0.01

表2 各组大鼠黑质纹状体中多巴胺含量、各组大鼠脑组织细胞凋亡检测、各组大鼠黑质中bax、bcl-2表达

注：与空白对照组比较，*P<0.01；与模型对照组比较，#P<0.01；与头针组比较，△P<0.01；与电针组比较，☆P<0.01

讨 论

黑质多巴胺能神经元缺失是PD的病理变化，以坏死为主是PD中多巴胺神经元丢失的主要方式，多巴胺神经元的死亡过程是由细胞凋亡参与的[3-4]，黑质多巴胺神经元丢失的主要途径之一可能是细胞凋亡。目前可用于PD的治疗有多种方法，可是长期应用西药疗效较差，有时出现毒副作用，临床针灸治疗PD已取得一定的成效，根据中医理论和临床经验针灸具有一定抗PD作用[5]。

PD的发病机制及病因尚不清楚[6]，最近科研[7-10]表明，在神经退行性疾病发病中起重要作用可能线粒体功能障碍。黑质致密部DA能神经元的凋亡在不同因素引起的PD最终都有表现，在PD的发病过程中有一条共同的通道——细胞凋亡。激发神经细胞发生凋亡的决定因素是bax与bcl-2的比率，各种神经细胞损伤的启动子是bax(包含DA能神经细胞损伤由6-OHDA所致的)，作为前凋亡蛋白在诱导和启动黑质细胞凋亡方面，它起着关键性的作用。综上所述bcl-2在抗凋亡中的存在积极的影响，它在治疗PD上存在潜在的优势[11]。

Mochizuki 等[12]经过 TUNEL检测发现黑质多巴胺能神经元发生细胞凋亡，前人研究表明，细胞凋亡参与了帕金森病的发病过程，曹非等[13]的实验研究也证实了这一观点。采用TUNEL的方法，证明 PD 大鼠模型黑质损伤侧呈现典型的黑质凋亡细胞的存在[14]，证实了细胞凋亡参与大鼠帕金森病的发病。

电针主要是通过电针仪持续刺激穴位,来代替行针过程以提高临床疗效。Toosizadeh[15]、王晓颖[16]、杨秀毅[17]等发现电针能够使帕金森病患者姿态得到平衡,整体症状得到缓减。现代医家张继海[18]、杨焱[19]、姜雪梅[20]等用头皮穴疗法对帕金森病患者进行临床观察,经治疗四肢震颤幅度显著降低,下颌颤动基本消失，活动更加自如,睡眠障碍得到很好的改善。电针头皮穴在治疗帕金森病也有很好的疗效，王淑杰[21]，钱浩[22]，梁昕[23]等结果发现电针头皮穴可以减少PD患者黑质纹状体多巴胺的丢失[24],保护多巴胺神经元延缓PD患者疾病的进程,减轻临床症状。

本实验结果显示，模型对照组黑质纹状体中DA含量减少，细胞凋亡数增多，大鼠中脑黑质bcl-2表达显著减少，bax表达显著增加；各针刺组大鼠黑质纹状体中DA含量增多，凋亡细胞数减少，bcl-2表达水平上调，bax表达水平下调，其中尤以头针+电针组变化最为明显。提示：电针及头针干预措施均可提高PD大鼠黑质多巴胺能神经元合成多巴胺的功能,减少细胞凋亡的发生，改善大鼠大鼠的行为学，上调bcl-2表达，抑制bax表达。而电针、头针联合针刺方案对多巴胺、细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的调控作用更为显著。由此我们推测，电针和头针疗法治疗PD的疗效与抗黑质纹状体细胞凋亡密切相关，其抗凋亡作用可能是通过调控凋亡相关蛋白bax、bcl-2的表达水平而实现的，二者联用作用更为显著。该结论为电针与头针联用治疗帕金森的临床应用提供了理论支持。