QuEChERS-HPLC-MS/MS测定柑橘类水果中柑橘红2号染料

杨明，许晴，李首道，田甜，涂凤琴*，郦娟

武汉食品化妆品检验所（武汉 430012）

柑橘红2号（Citrus red No.2）是一种橘红色人造染料，具有潜在的致癌性[1]。世界范围内，除了美国和加拿大允许在一些特定条件下使用柑橘红2号染料[2]，且规定全果中柑橘红2号染料最大残留量不得超过2 mg/kg，其他国家都禁止使用[3]。但在利益驱使下，一些不法商贩违规将其用于柑橘类水果增色以吸引消费者眼球，提高市场竞争力，给消费者造成较大健康风险。因此，建立高效、快速、灵敏的分析方法加强柑橘类水果中柑橘红2号染料的监测，对于保障人民群众的食品安全具有重要意义。

柑橘红2号染料的检测方法主要有表面增强拉曼光谱法（SERS）[4]、高效液相色谱法（HPLC）[3,5-9]和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[10-12]等。其中，高效液相色谱法应用较为广泛，但其检测灵敏度较低，定性能力较弱，易出现假阳性结果。而液相色谱-串联质谱法以其高选择性、高灵敏度和优异的定性定量能力等特性，能够很大程度上提高方法灵敏度和测定结果的准确性。在前处理技术方面，已报道的分析方法中大多采用乙腈、石油醚或正己烷-丙酮提取样品中的柑橘红2号染料后，经NH2固相萃取小柱或中性氧化铝小柱净化，前处理步骤较为繁琐，提取液通常需先经浓缩与复溶，再进行净化处理，检测周期较长。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）技术是Anastassiades等[13]提出的一种快速、简便、廉价、高效、耐用且安全的前处理技术，具有操作简便、成本低、基质适用范围广等优点，被广泛应用于农药残留检测、兽药残留检测和真菌毒素分析等领域[14-19]。采用QuEChERS前处理技术的有关柑橘红2号染料检测方法少见报道。试验采用QuEChERS样品处理技术结合HPLC-MS/MS，建立柑橘类水果中柑橘红2号染料的分析方法。该方法简单、快速，灵敏度高，准确性好。与文献方法[10-11]比较，由于使用QuEChERS技术，方法的试剂用量相对更少，成本低，操作简便快速。前处理过程中，提取液无需浓缩，简化操作步骤，提高检测效率，能满足实际样品的快速测定要求。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Agilent 6460三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent公司）；Allegra X-15R Centrifuge离心机（美国贝克曼库尔特公司）；Vortex-Genie 2涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）；PM5-2000TL超声波清洗器（普律玛仪器公司）。

1.2 试剂与材料

甲醇、乙腈、乙酸铵（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司）；柑橘红2号标准品（纯度≥98.0%，First Standard）；十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、石墨化碳黑（Graphitized carbon black，GCB）和N-丙基乙二胺（Primary secondary amine，PSA）吸附剂（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；无水硫酸镁和氯化钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水（18.2 MΩ·cm，由Milli-Q纯水仪制得）；0.1%甲酸溶液（准确量取1 mL甲酸，用纯水定容至1 000 mL）；10 mmol/L乙酸铵溶液（称取0.77 g乙酸铵，用纯水溶解并定容至1 000 mL）。

1.3 色谱条件

Waters Xbridge C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；柱温40 ℃；进样量5 μL；流速0.3 mL/min；流动相A含0.1% HCOOH的10 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B乙腈。梯度洗脱程序：0～3.0 min，20%～90%B；3.0～7.0 min，90% B；7.0～7.1 min，90%～20% B；7.1～9.0 min，90% B。

1.4 质谱条件

离子源，AJS ESI源；扫描模式，正离子扫描；检测方式，多反应监测（MRM）采集模式；毛细管电压（IS）4 000 V；干燥气流速5 L/min；干燥气温度250℃；雾化气压力45 psi；鞘气温度320 ℃；鞘气流速11 L/min。

1.5 样品处理

称取2 g（精确至0.000 1 g）均质样品置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL乙腈，振荡提取30 min，加入2 g氯化钠，剧烈振摇1 min，以4 500 r/min离心10 min，待净化。移取1.5 mL待净化上清液加入到含有150 mg MgSO4、50 mg C18、50 mg PSA和50 mg GCB的净化管中，涡旋振荡1 min，以4 500 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.6 基质匹配标准溶液

准确称取适量的柑橘红2号标准品，用乙腈溶解并定容，配制质量浓度200 μg/mL的标准储备溶液，于4 ℃保存；根据需要，将标准储备液用乙腈稀释成适当浓度的标准工作溶液。分别准确移取适量的标准工作溶液，用空白样品基质提取液配制成质量浓度为0.05，0.2，0.5，2.0，5.0和20 ng/mL的系列基质匹配标准工作溶液，基质匹配标准溶液现用现配。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

试验选择Waters Xbridge C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）进行分离分析，并考察柑橘红2号在乙腈-水、乙腈-乙酸铵水、甲醇-水、甲醇-乙酸铵水等不同流动相组成中的色谱行为。结果表明柑橘红2号在乙腈-乙酸铵水组成的流动相中响应较高，因此选择乙腈-乙酸铵水为色谱流动相，并比较不同浓度乙酸铵溶液对目标物的影响情况。结果表明乙酸铵浓度10 mmol/L时，柑橘红2号的响应较好，峰形尖锐，因此选择在水相中加入的乙酸铵浓度为10 mmol/L。在流动相中加入甲酸通常可以提高正离子模式下物质的离子化效率，进而增强其质谱响应。试验表明，在10 mmol/L乙酸铵水溶液中加入0.1%甲酸（HCOOH）时，柑橘红2号的响应显著提高，峰形对称。因此选择乙腈和含0.1% HCOOH的10 mmol/L乙酸铵水溶液为色谱流动相。

2.2 提取溶剂的选择

试验比较甲醇、乙腈、0.5%甲酸甲醇、0.5%甲酸乙腈等溶剂的提取效果，发现甲醇提取的杂质较多，相比之下乙腈的提取效率高，提取效果较好，因此选择乙腈作为提取溶剂。样品基质中含有水，为促进水和乙腈分层，通常需加入盐析试剂。试验结果表明，加入2 g氯化钠较为适宜，盐析效果较好，可使水相与乙腈相具有良好分层效果。

2.3 吸附剂的选择

C18、PSA和GCB是QuEChERS技术中常用的吸附剂。C18能除去脂类等非极性物质；PSA能除去糖类、有机酸、脂肪酸、多酚等干扰物；GCB常用于吸附叶绿素、类胡萝卜素等色素。试验考察单一C18、PSA和GCB，以及三者的不同组合对柑橘红2号回收率的影响。结果表明，C18、PSA和GCB三者组合使用净化效果较好。无水硫酸镁（MgSO4）常用于除去提取液中的水分，试验选择C18、PSA、GCB和MgSO4为吸附剂，并考察吸附剂的用量对样品添加回收率的影响。MgSO4+C18+PSA+GCB为150 mg+50 mg+50 mg+50 mg时，净化效果最佳，柑橘红2号回收率高。因此，选择150 mg MgSO4、50 mg C18、50 mg PSA和50 mg GCB的混合吸附剂。

2.4 质谱条件优化

考察柑橘红2号在不同电离模式下的质谱响应。结果表明，在电喷雾正离子扫描模式下，柑橘红2号的响应良好，灵敏度高。在一级质谱扫描模式下，得到柑橘红2号的准分子离子峰[M+H]+m/z 309.0。根据二级质谱扫描得到的二级碎片离子质谱图，选取响应良好、干扰少的3对子离子m/z 278.0，m/z 153.1和m/z 138.1组成监测离子对，m/z 309.0→153.1为定量离子对，m/z 309.0→278.0和m/z 309.0→138.1为定性离子对，并进一步优化每个离子对的最佳碰撞能量（CE）。柑橘红2号的母离子、子离子、碎裂电压（Fragmentor）、碰撞能量（CE）等质谱参数列于表1。图1为柑橘红2号标准溶液的多反应监测（MRM）色谱图。

2.5 基质效应

基质效应（Matrix effect，ME）是指样品分析时的共流出组分引起的分析信号增强或抑制现象[20]。基质效应通常以基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值来表示，比值0.85～1.15时，基质效应较弱；比值大于1.15时，存在较强的基质增强效应；比值小于0.85时，存在较强的基质抑制效应。试验采用溶剂和空白基质提取液分别配制相同浓度的系列标准溶液，通过比较基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率来考察基质效应。结果表明，实际样品基质对柑橘红2号存在一定的离子化增强效应，ME为1.07。因此，采用基质匹配的标准曲线进行定量，以补偿基质效应对测定结果的影响，使定量结果更加准确可靠。

2.6 线性关系、检出限与定量限

在优化的前处理和测定条件下，对配制的系列质量浓度的基质空白标准工作溶液进行测定，以柑橘红2号的定量离子峰面积为纵坐标（y），相应的质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线。结果表明，柑橘红2号在0.05～20 ng/mL质量浓度范围内具有良好的线性关系，线性方程为y=3 508.1x+58.6，相关系数r=0.999 2。在此次试验测定条件下，柑橘红2号的检出限（S/N≥3）为0.025 μg/kg，定量限（S/N≥10）为0.1 μg/kg。

2.7 回收率和精密度

分别在空白基质样品中添加4个不同浓度水平（0.25，1.0，5.0和50 μg/kg）的标准溶液，按该方法预处理，每个添加水平测定6次，计算回收率和精密度（以相对标准偏差表示）。柑橘红2号的平均回收率为81.9%～94.7%，相对标准偏差（RSD，n=6）为2.6%～7.3%（表2）。结果表明，该方法回收率高、稳定性好，适用于柑橘类水果中柑橘红2号的测定。

表1 柑橘红2号的母离子、子离子等重要质谱参数

图1 柑橘红2号基质空白标准溶液的多反应监测（MRM）色谱图

表2 柑橘红2号的平均加标回收率和相对标准偏差（n=6）

2.8 实际样品测定

采用该方法对市售的20批次柑橘样品进行测定。结果表明样品中均未检出柑橘红2号。

3 结论

采用优化的QuEChERS前处理技术结合高效液相色谱-串联质谱检测技术，建立柑橘红2号的快速分析方法，并用于实际样品测定。方法前处理简单快速、灵敏度高、重现性好，能实现柑橘类水果中柑橘红2号的快速、灵敏检测，具有较高的实用价值和推广价值。