UHPLC-MS/MS法测定猪肉和牛肉中的高氯酸盐

黄永桥，马凯*，吴新文，曹俊杰，简银池

贵州省分析测试研究院（贵阳 550000）

高氯酸盐（Perchlorate）是一类化学性质稳定、含有高氯酸根的化学物质，被广泛应用于工业和民用中，如航空航天染料中的氧化剂[1-3]。高氯酸盐也是一种新型健康危害物，其对人体的危害主要表现在：抑制体内碘转运与摄取，从而引发甲状腺功能障碍；影响婴幼儿新陈代谢和脑组织发育，进而引发智力缺陷等先天性疾病[4-7]。环境中的高氯酸盐，因其极易溶于水，借助水的流动和空气的扩散，经不同生物吸收并在生物链逐级富集，最终对人体的安全构成威胁[8-9]。

目前高氯酸盐的检测方法主要有离子色谱法[10-11]、离子色谱-质谱联用法[9,12]、高效液相色谱-质谱联用法[13-14]、表面增强拉曼散射技术[2,15]，其中超高效液相色谱-质谱联用法因其高效、准确、灵敏度高、定量准确等优点而在高氯酸盐检测中应用较多[16]。目前关于猪肉、牛肉中高氯酸盐的检测报道较少，试验建立了适用于猪肉、牛肉中高氯酸盐的超高效液相色谱-质谱联用仪的检测方法，其具有样品前处理简便、快速，检测灵敏度高、结果精密度好等优点。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

Agilent 1290-6470超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，配有ESI源（美国Agilent公司）；电子天平（常熟市天量仪器有限公司）；Milli-Q超纯水机（美国 Millipore公司）；涡旋混合器（上海米青科实业有限公司）；超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；PRiME HLB（3cc/150 mg美国 Waters公司）；0.22 μ m滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）；

高氯酸钠标准品（上海安谱实验科技股份有限公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；甲醇（色谱纯，德国Merck公司）；甲酸铵（上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 标准溶液的配制

精密称取0.123 8 g高氯酸钠于100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，混匀，配制成质量浓度为1.00 mg/mL标准储备液，于4 ℃保存。5.0 μg/mL标准溶液配制：从1.0 mg/mL标准储备液中移取50 μL至10 mL容量瓶中，用超纯水稀释并定容至刻度；50.0 ng/mL标准溶液配制：移取100 μL的5.0 μg/mL标准溶至10 mL容量瓶中，用超纯水稀释并定容至刻度；5.0 ng/mL工作标准溶液的配制：移取1.0 mL的中间标液至10 mL的容量瓶中，用超纯水稀释并定容至刻度。

1.3 色谱条件

色谱柱：Thermo Acclaim TRINITY P1离子交换色谱柱（50 mm×2.1 mm，3 μ m）。流动相A：20 mmol/L甲酸铵溶液。流动相B：乙腈。流速：0.5 mL/min。柱温：40 ℃。进样体积：10 μ L。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相洗脱梯度

1.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；多反应监测（MRM），负离子扫描。毛细管电压：3.5 kV。干燥气流速：12 L/min。干燥气温度：350 ℃。鞘气流速：10 L/min。鞘气温度：300 ℃。其他质谱条件见表2。

表2 高氯酸盐的质谱条件

1.5 样品前处理

称取2.0 g捣碎后的组织样品于50 mL具塞离心管中，准确加入20 mL甲醇-水溶液（7︰3，V/V），以10 000 r/min均质1 min，涡旋2 min，以5 000 r/min常温离心10 min，吸取3.0 mL上述上清液过固相萃取柱，弃去部分流出液，收集剩余续滤液，过0.22 μm再生纤维素滤膜至样品瓶中，供仪器待测。

2 结果与分析

2.1 萃取柱的选择

试验对比了C18小柱和PRiME HLB（3 cc/150 mg）小柱的保留效果。通过基质加标试验发现采用PRiME HLB（3 cc/150 mg）柱净化，平均回收率为93.4%；采用C18柱净化，平均回收率为84.6%。由于PRiME HLB（3 cc/150 mg）使用时具有不用活化、操作简单、省时的特点，故选取PRiME HLB（3 cc/150 mg）柱作为净化柱。

2.2 色谱柱的选择

试验对比了C18色谱柱和Thermo Acclaim TRINITY P1色谱柱。由图1和图2可知，用C18色谱柱出峰时间小于1 min，通过调节流动相组成和比例也没有明显改善，不能将高氯酸盐与杂质进行分离分析。Thermo Acclaim TRINITY P1色谱柱采用独特的多模式表面化学键合相，表面化学键合相同时提供反相、阳离子交换和阴离子交换功能。Thermo Acclaim TRINITY P1色谱柱能对高氯酸盐和杂质进行有效的分离，且目标物有较好的响应，故选取Thermo Acclaim TRINITY P1色谱柱。

图1 C18色谱柱图谱

图2 Thermo Acclaim TRINITY P1色谱柱图谱

2.3 方法的标准曲线、检出限、定量限

按照1.2中配制出的标准工作溶液，用初始流动相稀释至1/100，1/50，1/20，1/10，1/5，1/2和1倍，得到系列梯度混合溶液。以对照品的峰面积（Y）对其质量浓度（X，μg/L）做标准曲线，结果表明，高氯酸盐在0.05～5.00 μg/L的质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数（R2）在0.999 2～0.999 3之间，适用于定量分析。按照信噪比≥3（S/N≥3）及信噪比≥10（S/N≥10）分别对最低检测限及定量限进行测定，由表3可知，该方法具有较好的灵敏度。

表3 高氯酸盐的线性范围、线性方程、相关系数（R2）、检出限和定量限

2.4 精密度及加标回收试验

选取猪肉和牛肉阴性样品，分别进行精密度及加标回收试验，选择检出限的1，2和10倍三个不同的添加量进行加标试验，每个添加水平做6个平行，按照1.5样品前处理方法进行提取净化。空白样品和加标样品见图3和图4。如表4所示，三个添加水平的平均回收率分别为：猪肉85.2%～98.8%和牛肉90.8%～106.0%。相对标准偏差（RSD）分别为：猪肉1.97%～3.87%和牛肉1.14%～%4.32%。该法具有较好的重复性与灵敏度，适用于定量分析，该样品前处理方法具有较高的回收率。

表4 猪肉和牛肉中高氯酸盐的添加回收率和相对标准偏差（n=6）

图3 空白样样品

图4 加标样品

2.5 实际样品检测

采用此次试验建立的方法检测实验室在流通环节抽取的300批次猪肉样品、100批次牛肉样品，其中有7份猪肉样品和3份牛肉样品检出高氯酸盐，其他样品均低于定量限。

3 结论

试验采用PRiME HLB小柱对样品进行快速前处理，建立了测定猪肉、牛肉中高氯酸盐的超高效液相色谱-串联质谱法，该方法操作简单，精密度和灵敏度高、定量准确、可靠，能满足猪肉、牛肉中高氯酸盐的日常检测工作。