热回流法提取甘草中甘草酸的工艺优化及HPLC法测定含量

王振强，耿悦，王浩，娄军晖

1. 黄河水利职业技术学院（开封 475003）；2. 天津科技大学食品工程与生物技术学院（天津 300457）；3. 旭梅（开封）生物科技有限公司（开封 475003）

甘草（Glycyrrhiza）又名甜草根，为豆科甘草属多年生草本植物[1]，适宜生长于我国西北部和北部半干燥温凉气候区[2]。甘草为众药之王[3]，以根茎入药，含有甘草酸（Glycyrrhizic acid）、甘草次酸（Glycyrrhetic acid）、甘草苷（Liquiritin）、甘草苷元（Glabrene）、甘草素等多种活性物质[4]，味甘、性平，具有补脾益气、止咳祛痰、消热解毒、调和百药等功效[5]。

甘草酸是从甘草根、茎中提取的一种有效活性成分，纯品甘草酸为白色晶体，难溶于冷水，可溶于热水，是非常珍贵的天然皂苷，具有抗氧化及促肾上腺皮质激素（ACTH）样活性[6]。甘草酸及其系列产品，对肉瘤、癌细胞生长有抑制作用，对艾滋病的抑制率高达90%，有较强的增加人体免疫功能作用，而且也是很好的食品添加剂和香料基料[7]。近年来，甘草酸在医药、化工、食品等行业得到了广泛的应用[8]，具有重要的研究价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘草，产自内蒙古；甲醇、乙酸铵、冰乙酸、苯酚、硫酸、甲醇、无水乙醇等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Modlel 525型高效液相色谱仪（天津市兰博实验仪器设备有限公司）；色谱柱C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：天津市兰博实验仪器设备有限公司；FA 1604 S电子分析天平（上海天平仪器厂）；DG 404型真空电热干燥箱（天津市天宇实验仪器有限公司）；LG 16-W型离心机（北京医用离心机厂）；QL-901微型漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司）；RE-52 CS-2型旋转蒸发器（上海雅荣生化设备仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

甘草经室温干燥后磨成粉末备用。

1.3.2 甘草酸提取单因素试验

1.3.2.1 提取温度对甘草酸提取的影响

准确称取1.0 g甘草粉末，置于圆底烧瓶中，以蒸馏水为提取溶剂，按料液比1︰30（g/mL）加入蒸馏水，分别在50，60，70，80，90和100 ℃水浴下，热回流提取0.5 h，提取5次，离心分离（5 000 r/min，15 min），浸提液置于100 mL容量瓶，定容。分别取2 mL置于试管中，于105 ℃烘干，将烘干后的样品加入2 mL流动相，混匀，过滤，测定甘草酸得率。取10 μ L进行HPLC检测，记录峰面积。

1.3.2.2 料液比对提取效果的影响

准确称取1.0 g甘草粉末，置于圆底烧瓶中，以蒸馏水为提取溶剂，按料液比分别为1︰15，1︰20，1︰25，1︰30和1︰35（g/mL）分别加入蒸馏水，在90 ℃水浴下，热回流提0.5 h，提取5次，离心分离（5 000 r/min，15 min），浸提液置于100 mL容量瓶，定容。分别取2 mL置于试管中，于105 ℃烘干，将烘干后的样品加入2 mL流动相，混匀，过滤，测定甘草酸得率。取10 μL进行HPLC检测，记录峰面积。

1.3.2.3 提取时间对甘草酸提取的影响

准确称取1.0 g甘草粉末，置于圆底烧瓶中，以蒸馏水为提取溶剂，按料液比1︰30（g/mL）加入蒸馏水，在90 ℃水浴下，分别热回流提取0.5，1，1.5，2，2.5和3 h，离心分离（5 000 r/min，15 min），提取5次，浸提液置于100 mL容量瓶，定容。分别取2 mL置于试管中，于105 ℃烘干，将烘干后的样品加入2 mL流动相，混匀，过滤，测定甘草酸得率。取10 μL进行HPLC检测，记录峰面积。

1.3.2.4 提取次数对甘草酸提取的影响

准确称取1.0 g甘草粉末，置于圆底烧瓶中，以蒸馏水为提取溶剂，按料液比1︰30（g/mL）加入蒸馏水，在90 ℃水浴下，分别热回流提取2，3，4，5和6次，提取0.5 h，离心分离（5 000 r/min，15 min），浸提液置于100 mL容量瓶，定容。分别取2 mL置于试管中，于105 ℃烘干，将烘干后的样品加入2 mL流动相，混匀，过滤，测定甘草酸得率。取10 μL进行HPLC检测，记录峰面积。

1.3.3 正交试验设计

在单因素试验的基础上，选取提取温度、料液比、提取时间、提取次数为因素水平，以甘草酸提取得率为试验结果，设计L16(45)正交试验，优化甘草酸提取工艺条件。正交试验条件因素水平见表1。

1.3.4 高效液相法测甘草酸含量

1.3.4.1 甘草酸提取得率计算[9]

式中：V表示样品体积，mL；M表示由甘草酸铵标准曲线计算的样品质量浓度，mg/mL；W表示甘草粉末质量，g。

表1 正交试验因素水平表

1.3.4.2 色谱条件

C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），理论板数按甘草酸峰计，3 500；流动相，甲醇-醋酸铵（0.2 mol/L）-冰乙酸（66︰33︰1）；流速，1.0 mL/min；检测波长，250 nm；柱温，25 ℃；进样量，10 μL。

1.3.4.3 对照样品溶液的制备

准确称取12.1 mg甘草酸铵标准品（90%），加入10.0 mL流动相，制成1.21 mg/mL的溶液。

1.3.4.4 标准曲线绘制[10]

分别吸取0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mL对照样品溶液，置于10 mL量瓶中，加流动相至刻度，按1.3.4.2小节各进样10 μL，采用HPLC测定峰面积，以峰面积积分值为横坐标，甘草酸铵的浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 甘草酸提取单因素试验

2.1.1 提取温度的确定

根据1.3.2.1小节进行试验，提取温度对甘草酸提取效果的影响如图1所示。随着提取温度的升高，甘草酸提取得率逐渐增大，当温度升至70 ℃时，再升高提取温度，甘草酸提取得率开始逐渐降低。综合分析，提取温度为70 ℃比较合适。

图1 提取温度对甘草酸提取效果的影响

2.1.2 料液比的确定

根据1.3.2.2小节进行试验，料液比对甘草酸提取效果的影响如图2所示。随着提取溶剂量的逐渐加大，甘草酸提取得率也缓慢增加；当料液比为1︰25（g/mL）时，再增加提取溶剂量，甘草酸提取得率显著增大，考虑到提取溶剂加入过大，溶液太稀不利于甘草酸的提取，结合经济效益分析，料液比为1︰30（g/mL）比较合适。

图2 料液比对甘草酸提取效果的影响

2.1.3 提取时间的确定

根据1.3.2.3小节进行试验，提取时间对甘草酸提取效果的影响如图3所示。随着提取时间的增大，甘草酸提取得率逐渐增大，当提取时间增加到1 h时，再增加提取时间，甘草酸提取得率开始缓慢下降，这可能是甘草酸随着时间的延长被破坏所致；另外，提取时间越长，耗能越大。综合分析，提取时间为1 h比较合适。

图3 提取时间对甘草酸提取效果的影响

2.1.4 提取次数的确定

根据1.3.2.4小节进行试验，提取次数对甘草酸提取效果的影响如图4所示。随着提取次数的增加，甘草酸提取得率也逐渐增加，当提取次数达到5次时，再增大提取次数，甘草酸提取得率变化不大，这是因为甘草中甘草酸析出已接近最大值，继续增加提取次数，对甘草酸提取影响很小。综合分析，提取次数为5次比较合适。

2.2 正交试验结果及方差分析

根据单因素试验结果，设计L16(45)正交试验，优化甘草酸提取工艺条件。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

由表2和表3结果可以看出，正交试验优化甘草酸提取工艺的最佳工艺条件为A4B4C1D4，即提取温度90℃，料液比1︰30（g/mL），提取时间0.5 h，提取次数5次；各因素对提取效果的影响顺序为A＞D＞B＞C，即提取温度＞提取次数＞料液比＞提取时间；提取温度、料液比和提取次数均显著影响甘草酸得率。在最佳提取工艺条件下进行验证试验，甘草酸得率为2.27%，与正交试验结果理论值2.33%基本一致。

图4 提取次数对甘草酸提取效果的影响

表2 正交试验结果

2.3 高效液相法测定甘草酸含量标准曲线

根据1.3.4.4小节绘制甘草酸铵标准曲线，结果见图5。甘草酸铵标准曲线的回归方程为y=3×10-7x+0.012 8，R2=0.999 9，线性范围为0.030 25～0.484 mg/mL。

图5 甘草酸铵标准曲线

3 结论

在单因素试验基础上，正交试验优化甘草酸提取工艺的最佳提取条件为提取温度90 ℃、料液比1︰30（g/mL）、提取时间0.5 h、提取次数5次；提取温度、料液比和提取次数均显著影响甘草酸得率；在最佳提取工艺条件下进行验证试验，甘草酸得率为2.27%，与正交试验结果理论值2.33%基本一致。采用HPLC法测定甘草酸含量，标准曲线回归方程为y=3×10-7x+0.012 8，R2=0.999 9，线性范围为0.030 25～0.484 mg/mL。

该研究为甘草酸进行深加工综合利用、开发系列产品提供理论参考依据。