灵芝液体培养基优化及饮品加工工艺

许俊齐，曹正*，王瑞，凡军民，谢正林，刘勇

江苏农林职业技术学院茶与食品科技学院（句容 212400）

灵芝（Ganoderma lucidum）属真菌门，担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，灵芝属，是一种珍贵的药用真菌，含有多种生物活性物质，如灵芝多糖、三萜类化合物和多种酶类，具有极高的营养保健和药用价值[1]。中国古代称其子实体为“仙草”[2-3]。

文献报道表明，多糖类物质（Polysaccharides）作为灵芝主要的有效化学物质之一，灵芝多糖具有调节免疫能力、抗肿瘤、抗氧化、抗HIV、降血压等生物活性，且经毒理学验证表明，灵芝多糖不会对人体健康造成负面影响[4-6]。灵芝多糖主要来源于固态发酵中的子实体和孢子以及液体发酵中的菌丝体和胞外发酵液，其产量的高低与试验菌株、培养基和培养条件等因素密切相关[7-9]。

近年来由于野生灵芝资源有限且人工栽培灵芝子实体周期较长、栽培成本高，限制了灵芝的广泛应用。目前，利用发酵技术生产真菌具有容积大、产量高、周期短和无污染等特点，已成为医药和保健品、化妆品等原料的重要生产方式[9]。通过液体发酵所得灵芝菌丝体，产品苦味小，营养价值及有效成分不低于子实体，甚至有些指标高于子实体，因而具有广阔的开发和应用前景[10-11]。

试验通过对灵芝进行液体深层发酵培养，分析相应碳源、氮源及培养温度与装液量对其菌丝干质量与总多糖含量的影响。在此基础上，进行灵芝菌丝发酵饮品调配配方进行优化，以期为灵芝菌丝产品的开发提供借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灵芝菌种及金针菇，江苏食用菌研究所所提供；纤维素酶（120 U/g），任丘市力辉化工有限公司；食盐、马铃薯等，市售；葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、蛋白胨和可溶性淀粉，国药集团化学试剂有限公司。

恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；FA 2104 N分析天平，上海精密科学仪器有限公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；DHG-9123 A电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；L 520微波炉，合肥荣事达三洋电器股份有限公司；CH 2176电磁炉，杭州九阳生活电器有限公司；HS-6恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

马铃薯200 g，葡萄糖 20 g，琼脂20 g，磷酸二氢钾2 g，硫酸镁1 g，VB110 mg，水1 000 mL。

1.2.2 一级摇瓶培养基

葡萄糖2%，酵母浸出膏15%，蛋白胨0.2%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，VB10.005%，余量为水。

1.2.3 二级摇瓶培养基

马铃薯20%，蔗糖2%，硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0. 05%，VB10.005%，余量为水。

1.2.4 发酵培养基

可溶性淀粉6%，葡萄糖2%，蛋白胨0.8%，硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，VB10.005%，余量为水。

1.3 试验方法

1.3.1 灵芝菌丝饮品加工步骤

1.3.1.1 菌种活化

将灵芝菌种接种到斜面培养基上，在28 ℃的生化培养箱中培养5～7 d左右，菌丝可长满试管。

1.3.1.2 一级摇瓶培养

将经过活化的灵芝菌种接种到摇瓶培养基中（500 mL的三角瓶装液150 mL），一级摇瓶培养条件为接入经过斜面培养的灵芝菌种2 cm2，于28 ℃条件下，振荡培养5～6 d。

1.3.1.3 二级摇瓶培养

将一级摇瓶培养灵芝菌种的接种到摇瓶培养基中进行二级摇瓶培养，在28～30 ℃条件下，培养8 d，所得灵芝菌种为生产摇瓶二级种。

1.3.1.4 发酵培养

将二级种接入发酵培养基中，二级种与发酵培养基的体积比为10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵培养5 d，进行扩大培养，得到一级灵芝菌种。

1.3.1.5 发酵罐培养

一级灵芝菌种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养24～36 h后，过滤，得灵芝菌丝。

1.3.1.6 灵芝菌丝饮品制备

过滤后的灵芝菌丝球于35～40 ℃烘干至恒质量，粉碎后过200目筛。将灵芝菌丝球粉及适量水（1︰5）进行均质研磨，均质完成后将灵芝菌丝球混液中加入0.2%纤维素酶，混匀后于38 ℃条件下保温水解1.5 h，将混合料在100 ℃下杀菌10 min。

准备好的灵芝菌丝酶解滤液，分别加入溶解完成的果胶及黄原胶，再依次加入金针菇粉、鲜柚浓缩汁、蜂蜜、柠檬酸、柠檬酸钠，然后搅拌均匀，最后补水至配方规定的量；将定容后的料液加热至沸，趁热加灌入已灭菌的饮料瓶、压盖后105 ℃下杀菌10 min、冷却后得灵芝菌丝发酵饮品。

1.3.2 液体培养基成分及条件单因素试验

前期试验基础上，判定液体培养基中碳源可溶性淀粉含量、氮源中蛋白胨及培养温度与不同装液量的对灵芝液体菌丝生长情况存在显著影响，故设定可溶性淀粉添加比例为3%，4%，5%，6%和7%；蛋白胨添加量为0.6%，0.7%，0.8%，0.9%和1.0%；培养温度与装液量（以500 mL计）分别为20 ℃+120 mL，23 ℃+130 mL，26 ℃+150 mL，29 ℃+170 mL和32℃+180 mL，并以菌丝体干质量及总多糖含量为评价指标，试验重复3次，取平均值，确定三者最优的添加量。

1.3.3 正交试验

从单因素中筛选出的不同水平的可溶性淀粉浓度、蛋白胨、培养温度与不同装液量，并设置一列空白列，进行L9(34)正交试验，因素及水平设定见表1。每个处理3个重复，进行振荡培养，测定其菌丝体鲜质量及总多糖含量。

表1 灵芝液体培养基正交L9(34)试验因素与水平

1.3.4 正交试验

在前期试验基础上，认为鲜柚汁、金针菇粉及柠檬酸+柠檬酸钠为影响灵芝菌丝体发酵饮品的关键因素。分别设定蔗糖添加比例为4%，5%和6%；设置食盐添加量为0.01%，0.02%和0.03%，设置柠檬酸与柠檬酸钠添加比例为0.3%+0.03%，0.4%+0.04%和0.4%+0.04%，设置果胶与黄原胶添加比例为0.04%+0.06%，0.05%+0.08%和0.06%+0.1%，并设置一列空白列，进行L9(34)正交试验，因素及水平设定见表2。

表2 灵芝菌丝发酵饮品L9(34)试验因素与水平

1.3.5 指标测定方法

1.3.5.1 感官评定

取试样置于烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态。闻其气味，用温开水漱口，品尝滋味。感官品质得分为3个指标总和。感官评价由20名具有品评经验的食品专业同学进行评价，取其平均值。

外观（10～30分）：细腻润滑，组织连贯均一，无结块和分层、无固体析出、色泽一致，无沉淀。

口感（10～40分）：口感爽滑，口味醇厚。

风味（10～30分）：饮品的酸甜度适中、饮品香气浓厚，独特饮品酵香。

1.3.5.2 灵芝菌丝体干质量测定方法

灵芝菌丝体发酵液，采用100目筛网过滤，用称质量后的干燥滤纸抽滤，将菌丝体用蒸馏水抽滤3次，烘干至恒质量后称质量，即得灵芝菌丝体干质量。

1.3.5.3 总多糖测定

总多糖测定：参照苯酚-硫酸法[12]。

1.3.5.4 微生物指标的测定

菌落总数按照GB 4789.2—2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

灵芝菌丝对淀粉的利用率较高，可溶性淀粉属于缓慢型利用碳源，易于被灵芝菌丝体快速利用且可满足菌丝后期生长的需要，故灵芝液体菌种培养基中添加可溶性淀粉时，菌丝干质量及总多糖含量随添加比例的增高，而有所增加。可溶性淀粉添加量对灵芝菌丝体干质量及总多糖含量的影响具体见图1。结果表明，麦芽糖添加量分别为5%和6%时，灵芝菌丝总多糖含量为1.441 g/L，灵芝菌丝干质量达0.534 g/100 mL，可溶性淀粉添加量7%，菌丝干质量及总多糖含量与添加比例6%时增加不明显，故选择可溶性淀粉添加量6%作为灵芝菌丝生长最适添加比例。

图1 可溶性淀粉添加量对灵芝菌丝体干质量及总多糖含量的影响

蛋白胨富含有机氮化合物，亦含有一些维生素和糖类，常被作为微生物培养基的主要原料。蛋白胨添加量对灵芝菌丝体干质量及多糖含量的影响见图2。结果表明，蛋白胨添加量对灵芝菌丝干质量及总多糖含量影响较为明显，蛋白胨添加量0.8%时，每100 mL培养液中的菌丝鲜质量达0.539 g，总多糖含量达1.365 g/L。随添加比例增加，灵芝干质量增加不明显，总多糖含量反而趋于小幅下降。原因可能在于，过量营养对于菌丝增长并无明显作用，据此选择0.8%蛋白胨添加量为最适液体培养基添加量。

随着培养温度不断升高及装液量增加，灵芝菌丝干质量不断增加且总多糖含量也逐步增加，但在29 ℃后继续升温，菌丝量反而减少，可见29 ℃为最适培养温度，具体见表3。培养温度及装液量为29 ℃、170 mL时，菌丝干质量达0.534 g/100 mL，总多糖含量达1.414 g/L。培养基装液量多，发酵液中溶氧量就少，影响菌球的生长，而装液量过少，虽然溶氧量很大，但营养不足，菌丝干质量及多糖含量就低。故选择培养温度29 ℃及装液量170 mL为较佳的灵芝液体培养基的培养条件。

表3 培养温度及装液量对灵芝菌丝体干质量及总多糖含量的影响

2.2 灵芝液体培养基工艺优化

2.2.1 正交试验结果的极差分析

液体培养基L9(34)试验结果分析见表4。

由表4液体培养基优化正交试验表中的R值可知，影响灵芝菌丝干质量及总多糖含量的主次顺序皆为：A＞B＞C，即培养温度及装液量＞可溶性淀粉添加量＞蛋白胨添加量。根据液体培养基配方及培养条件优化的结果分析得出，优化后的配方为A2B3C3，即液体培养基最佳配比：培养温度29 ℃、装液量170 mL、可溶性淀粉添加量6.5%、蛋白胨添加量0.85%。灵芝菌丝在此配方及环境条件下生长状况良好，总多糖含量保持在较高水平。

对试验结果进行方差分析，即在试验条件下，培养温度及装液量与蛋白胨添加量对灵芝菌丝干质量及菌丝总多糖含量影响极显著（p＜0.01），可溶性淀粉添加量对两者影响显著（p＜0.05）。

表4 液体培养条件及培养基L9(34)试验结果分析

2.2.2 扩大性验证试验

获得的优化方案A2B3C3为试验中的9号试验组，为进一步确认其在实际生产中的可靠性与可行性，故以其为条件，即培养温度29 ℃、装液量170 mL、蛋白胨添加量0.85%、可溶性淀粉添加量6.5%，进行扩大性（中试）验证试验，试验重复3次，测定其菌丝干质量平均值为0.597±0.012 g/100 mL，总多糖含量为1.522±0.014 g/L试验结果与9号试验组相近，表明该配方为较佳的灵芝液体培养条件及其组成。

2.3 灵芝菌丝发酵饮品调配工艺优化

2.3.1 正交试验结果的极差分析

灵芝菌丝发酵饮品调配L9(34)试验结果见表5，灵芝菌丝鲜质量方差分析见表6。

从表5灵芝菌丝发酵饮品调配工艺的正交试验结果中的R值可知，影响其综合评分的因素主次顺序为B＞A＞C，即金针菇粉＞食盐添加量＞柠檬酸与柠檬酸钠。依据综合评分的结果分析可知，优化的工艺组合均为A2B3C3，即食盐添加量0.03%、金针菇粉添加量0.6%、柠檬酸0.06%+柠檬酸钠0.10%，制得的饮品外观、口感及风味的综合值均保持在最高。

对试验结果进行方差分析，表6数据显示，在试验条件下，食盐添加量与金针菇粉添加量对灵芝菌丝发酵饮品的综合口感影响显著（p＜0.05），而柠檬酸+柠檬酸钠对其影响不显著（p＞0.05）。

2.3.2 扩大性验证试验

获得的优化方案A2B3C3为试验第9组试验，为进一步确认其在实际生产中的可靠性与可行性，以其为条件，即灵芝菌丝饮品调配配方为：食盐添加量0.03%、金针菇粉添加量0.6%、柠檬酸0.06%+柠檬酸钠0.10%。进行扩大性（中试）验证试验，试验重复3次，经品评后，综合得分达85.8分，试验结果均优于正交试验的9组试验组，表明此配方为较佳的灵芝菌丝饮品的适宜配方。

2.4 微生物指标检验

灵芝菌丝饮品的微生物检验结果见表7。结果表明，灵芝菌丝饮品的细菌总数≤100 CFU/mL，大肠杆菌≤3 MPN/100 mL，致病菌未检出，符合GB 7101—2015《食品安全国家标准 饮料》中关于微生物限量要求。

表5 灵芝菌丝发酵饮品调配L9(34)试验结果

表6 灵芝菌丝饮品方差分析

表7 微生物检验结果

3 结论

对灵芝液体培养基碳源、氮源、培养温度及装液量进行优化，试验结果认为，培养温度29 ℃、装液量170 mL、蛋白胨添加量0.85%、可溶性淀粉添加量6.5%，灵芝菌丝体菌丝干质量平均值为0.597±0.012 g/100 mL，总多糖含量为1.522±0.014 g/L；在对灵芝菌丝发酵饮品调配工艺过程中，通过正交试验分析得出，最优组合为：食盐的添加量0.03%、金针菇粉添加量0.6%、柠檬酸0.06%+柠檬酸钠0.10%。综合感官评价认为，此配方制得的灵芝菌丝饮品在保证口感的同时，后期贮藏验证其稳定性也较高。

通过对在最佳工艺条件下制得的灵芝发酵菌丝饮料进行感官评价，其颜色均一，组织状态均匀，无沉淀分层现象，在保留灵芝菌丝原有的活性功能基础上，添加鲜柚浓缩汁及蜂蜜，使灵芝饮品的营养更加丰富，风味独特，口感更加细腻，具有良好的市场前景。