响应面法优化豌豆渣抗性糊精的制备工艺

竺鉴博，李朝阳，贾鹏禹，李良玉*

1. 大庆市萨尔图区政府市场监督局（大庆 163311）；2. 黑龙江八一农垦大学，国家杂粮工程技术研究中心（大庆 163319）

豌豆（Pisum sativum L.）是一种重要的可食用豆类，具有较高的营养价值[1-2]，在中国用于淀粉及其相关产品的生产，在此过程中会产生大量的加工副产物——豌豆渣。豌豆渣中含20%～30%的淀粉，4%～8%的蛋白及60%～70%的膳食纤维，目前，豌豆渣直接丢弃或作为饲料简单使用，造成资源浪费[3-4]。针对这一现状，研究提出一种豌豆渣综合利用的新模式，充分利用豌豆渣中的淀粉、蛋白及膳食纤维。主要针对豌豆渣中淀粉的综合利用进行研究，用于生产豌豆抗性糊精。抗性糊精是一种新型的水溶性膳食纤维，具有良好的加工特性[5]及功能特性[6-7]，很多科研者开展相关研究[8-9]，在食品加工中具有广阔的发展前景。试验采用豌豆渣为原料，采用酸热法制备豌豆抗性糊精，旨在探索豆类淀粉废弃物深加工的方法，为豆渣综合利用及产业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豌豆渣（山东六六顺食品有限公司）；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

酸度计（S220K，梅特勒·托利多）；液相色谱仪（1200s，安捷伦）。

1.3 试验方法

1.3.1 豌豆抗性糊精的制备工艺流程

①纤维→酶处理→精品膳食纤维

②上清液→等电点沉淀→豌豆蛋白→酶处理→豌豆蛋白肽

③沉淀→洗涤→淀粉→酸热处理→豌豆抗性糊精

豌豆渣经除杂后，采用石油醚提取油脂进行脱脂处理，利用淀粉与纤维的粒径分布范围不同，采用曲筛对淀粉及纤维进行分离。纤维经淀粉酶、蛋白酶处理后制备精品膳食纤维，淀粉乳采用稀碱液浸提3 h，以3 500 r/min离心10 min，上清液用于制备蛋白，沉淀用于生产淀粉。上清液采用等电点沉淀后，以4 500 r/min离心20 min，沉淀用水洗至中性，冷冻干燥制得豌豆蛋白，豌豆蛋白还可进行酶处理得到各种功能的豌豆蛋白肽[10]。沉淀采用去离子水反复冲洗，除去沉淀中上层黄褐色物质，直至淀粉浆呈白色，用1 mol/L盐酸调浆至pH 7.0，过滤，于30 ℃干燥，粉碎过80目筛，制得豌豆淀粉[11]。豌豆淀粉90 ℃预烘干1 h，去除水分，使含水量降至5%以下，喷雾加盐酸，160～200℃下热解1～2 h；完毕后取出自然冷却，将热解产物（焦糊精）加水制成溶液，用NaOH调为pH 5.5～6.5，0.5%耐高温α-淀粉酶在95 ℃反应1 h，0.4%糖化酶在60 ℃ pH 4.0～4.5条件下反应2 h，真空浓缩，即得到粗品豌豆抗性糊精，采用乙醇沉淀法纯化抗性糊精进行后续测定[12]。

1.3.2 单因素试验方法

1.3.2.1 盐酸浓度对抗性糊精含量的影响

称取制备的豌豆淀粉100 g，加盐酸浓度分别为0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4% 5个处理，加酸量为原料的7%，热解温度170 ℃，热解时间100 min，耐高温α-淀粉酶加酶量0.5%，95 ℃反应1 h。糖化酶加酶量0.4%，60 ℃反应2 h，真空浓缩后得到粗品抗性糊精。以豌豆抗性糊精含量为指标，采用Sigmaplot进行关系图的绘制，比较确定最佳的加酸浓度旋转试验中心水平。

1.3.2.2 盐酸添加量对抗性糊精含量的影响

称取制备的豌豆淀粉100 g，加盐酸浓度1%，加盐酸添加量分别为原料的4%，5%，6%，7%，8%，9%和10% 7个处理，热解温度170 ℃，热解时间100 min，耐高温α-淀粉酶加酶量0.5%，95 ℃反应1 h。糖化酶加酶量0.4%，60 ℃反应2 h，真空浓缩后得到粗品抗性糊精。以豌豆抗性糊精含量为指标，采用Sigmaplot进行关系图的绘制，比较确定最佳的盐酸添加量旋转试验中心水平。

1.3.2.3 处理温度对抗性糊精含量的影响

称取制备的豌豆淀粉100 g，加酸量分别为原料的7%，处理温度分别为150，160，170，180和190 ℃ 5个处理，处理时间100 min，耐高温α-淀粉酶加酶量0.5%，95 ℃反应1 h。糖化酶加酶量0.4%，60 ℃反应2 h，真空浓缩后得到粗品抗性糊精。以豌豆抗性糊精含量为指标，采用Sigmaplot进行关系图的绘制，比较确定最佳的处理温度旋转试验中心水平。

1.3.2.4 处理时间对抗性糊精含量的影响

称取制备的豌豆淀粉100 g，加盐酸浓度1%，加酸量分别为原料的7%，处理温度170 ℃，处理时间分别为80，90，100，110和120 min 5个处理，耐高温α-淀粉酶加酶量0.5%，95 ℃反应1 h。糖化酶加酶量0.4%，60 ℃反应2 h，真空浓缩后得到粗品抗性糊精。以豌豆抗性糊精含量为指标，采用Sigmaplot进行关系图的绘制，比较确定最佳的处理时间旋转试验中心水平。

1.3.3 响应面优化试验方法

在单因素试验基础上，采用响应面法优化提取过程，以豌豆抗性糊精的含量为Y，分别设置酸浓度（%）为X1，加酸量（%）为X2，处理温度（℃）为X3，处理时间（min）为X4，试验因素水平编码表见表1。

表1 因素水平编码表

1.3.4 测定方法

豌豆抗性糊精的含量测定方法参考李良玉等[13]的研究方法；分子量测定参考肖健等[14]的方法，利用排阻色谱-十八角度激光光散射仪-示差折光检测器联机系统测定豌豆抗性糊精的分子质量及分布情况；单糖组成分析参考Ciucanu等[15]的方法并稍作改动（样品处理全过程需要氮气保护），具体参考曹荣安等[16]的方法：进行还原和乙酰化处理，利用GC-MS分析，色谱柱为HP-5MS石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），根据气谱出峰时间和质谱的离子峰对单糖进行定性分析，确定豌豆抗性糊精的单糖组成。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 盐酸浓度对豌豆抗性糊精含量的影响

盐酸浓度对豌豆抗性糊精含量的影响，见图1。

结果表明，豌豆抗性糊精的含量随着盐酸浓度增加而不断增加；酸浓度大于1%，抗性糊精含量逐渐下降。这是可能是由于盐酸浓度较低时，盐酸浓度不够导致淀粉降解成小分子的能力不足，因此抗性糊精含量较低；盐酸浓度大于1%后，部分位置盐酸浓度过高导致盐酸分布不均匀，部分淀粉未与盐酸接触导致抗性糊精含量逐渐下降。因此，选择豌豆抗性糊精盐酸浓度旋转试验的中心点为1%。

图1 不同盐酸浓度与抗性糊精含量的关系

2.1.2 盐酸添加量对豌豆抗性糊精提取的影响

盐酸添加量对豌豆抗性糊精含量的影响，见图2。

结果表明，豌豆抗性糊精含量随着盐酸添加量增加而不断增加；盐酸添加量大于7%，抗性糊精含量趋于平衡，后续增加不显著。这是可能是由于盐酸添加量较低时，盐酸总量不够导致淀粉降解成小分子的能力不足，因此抗性糊精含量较低；盐酸添加量大于7%后，淀粉降解成小分子的能力较强，增加盐酸添加量不会显著增加抗性糊精含量，反而增加抗性糊精的颜色与气味，为后续的纯化和应用带来困难。因此，选择豌豆抗性糊精盐酸添加量旋转试验的中心点为7%。

2.1.3 处理温度对豌豆抗性糊精提取的影响

处理温度对豌豆抗性糊精含量的影响，见图3。

结果表明，随着处理温度不断升高，抗性糊精含量也随之提高，处理温度高于170 ℃，含量增加放缓，并趋于平衡。这是可能由于温度相对低时不利于抗性糊精的聚合，或者形成的聚合物易被淀粉酶降解，导致抗性糊精的含量较低。温度过高后，虽然抗性糊精含量有增加趋势但不显著，同时会影响抗性糊精的口感及后续处理，同时也考虑到经济性、设备的投入及使用寿命等因素，选择豌豆抗性糊精处理温度旋转试验的中心点为170 ℃。

图3 不同处理温度与抗性糊精含量的关系

2.1.4 处理时间对豌豆抗性糊精提取的影响

处理时间对豌豆抗性糊精含量的影响，见图4。

结果表明，随着处理时间不断升高，抗性糊精含量也随之提高，处理时间高于100 min，抗性糊精含量增加缓慢，并趋于平衡。这是可能由于时间不足时不利于抗性糊精的聚合，或者形成的聚合物易被淀粉酶降解，导致抗性糊精的含量较低。达到一定时间后，抗性糊精热解聚合完成，再继续增加时间只会使未聚合的葡萄糖等单糖发生变化，会影响抗性糊精的口感及后续的处理，同时也考虑到经济性、设备的投入及使用寿命等因素，选择豌豆抗性糊精处理时间旋转试验的中心点为100 min。

图4 不同处理温度与抗性糊精含量的关系

2.2 响应面优化试验的结果与分析

基于单因素试验结果，以X1（酸浓度），X2（加酸量），X3（处理温度），X4（处理时间）为自变量X，以豌豆抗性糊精含量为Y，进行响应面试验。对试验结果进行统计分析，回归模型R2=0.91，p＜0.01，失拟项的F值为0.21，p＞0.05，说明该模型拟和结果较好。一次项F=12.41、二次项F=24.87，p＜0.01；交互项F=4.07，p＜0.05，总体的F=12.39，p＜0.01，说明各项均不同程度影响豌豆抗性糊精含量。根据试验结果，以X1（酸浓度），X2（加酸量），X3（处理温度），X4（处理时间）为自变量X，以豌豆抗性糊精含量为Y，进行分析得到回归方程为Y=-4 559.53+641.46X1+99.36X2+32.13X3+22.39X4-481.15X12-35.25X1X2+2.8X1X3+1.1X1X4-4.7X22+0.03X2X3-0.07X32-0.1X3X4-0.03X42。

在回归方程的基础上进行分析，得到的最佳制备条件为，X1、X2、X3、X4标准化值分别为0.126，0.302，0.886和-0.747，换算为非标准化值后得到的具体值分别为：酸浓度（X1）1.03%、加酸量（X2）7.3%、处理温度（X3）178.86 ℃、处理时间（X4）92.53 min，理论最大值为42.38%，经验证试验得到豌豆抗性糊精含量为42.15%±0.16%，制得的豌豆抗性糊精的液相色谱图，见图5。

结果表明，制备豌豆抗性糊精中主要含有5个峰，主要有3个物质：抗性糊精（出峰时间9.974 min）、二糖（出峰时间10.962 min）、葡萄糖（出峰时间12.585 min），其中抗性糊精含量为41.08%。二糖应该为反应过程中形成的中间体，葡萄糖为末聚合的淀粉降解物，因此，得到的豌豆抗性糊精需要进行纯化，才能达到国际标准。

图5 豌豆抗性糊精液相分析图谱

2.3 分子量测定结果与分析

豌豆淀粉及豌豆抗性糊精分子量测定结果，见图6。

由图6与图7可以看出，豌豆淀粉及豌豆抗性糊精的示差折光检测曲线上均只有单一峰，说明两者的分子量相对集中，利用ASTRA 6.1软件进行分析，可知豌豆淀粉和豌豆抗性糊精的分子量（Mw）分别为（1 465.4±53.2）×103U和（601.1±8.5）×103U。

图6 豌豆淀粉的示差折光检测曲线

图7 纯化后豌豆抗性糊精的示差折光检测曲线

2.4 抗性糊精单糖组成测定结果与分析

豌豆淀粉及豌豆抗性糊精单糖组成测定结果，见表2。

结果表明，豌豆淀粉的单糖组成相对于豌豆抗性糊精较为多样，共含有6种单糖，而抗性糊精中的单糖组成只有3种，以葡萄糖为主，还有少量的阿拉伯糖及木糖。这可能是由于豌豆淀粉在酸热的条件下进行降解后，以葡萄糖为主体进行重聚合，阿拉伯糖及木糖参与这一过程，共同形成豌豆抗性糊精聚合体，而鼠李糖、甘露糖、半乳糖可能没有参与，因此，在豌豆抗性糊精的单糖组成中未检出。

表2 豌豆淀粉及豌豆抗性糊精的单糖组成

3 结论

通过试验确定豌豆抗性糊精的最佳制备工艺参数为：酸浓度1%、加酸量7.3%、处理温度178.8℃、处理时间92.5 min。得到豌豆抗性糊精含量为42.15%±0.16%。制得抗性糊精分子量为（601.1±8.5）×103U，单糖组成为阿拉伯糖2.6%、木糖1.5%、葡萄糖95.9%。研究为豌豆渣综合利用提供新思路，显著增加豌豆渣加工的附加值，可促进豌豆生产、加工等相关产业发展。