基于沉淀净化法的气相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中的肌醇

许文琪,吴凌,刘文菁,黄何何,黄永辉,胡朝阳

（福建省产品质量检验研究院，福州350002）

0 引 言

肌醇，又名环己六醇，是一种水溶性维生素，广泛存在于各种天然动物及微生物组织中，因最初是由肌肉组织中提取，故取名肌醇[1]。肌醇是一种“生物活素”，能够促进细胞生长和维持动物生理功能，对疾病具有免疫、预防和治疗作用。人体每天对肌醇的需求量是1～2 g，若缺乏将会出现生长停滞和毛发脱落等现象，所以在许多保健饮料和儿童食品中都加有微量肌醇[2]。在婴幼儿配方乳粉中，肌醇属于可选择性添加成分，GB 19765-2010、GB 19767-2010[3-4]对添加了肌醇的乳粉中肌醇的添加量均作出明确规定，规定肌醇含量为1.0～9.5 mg/100 k J，因此准确测定乳粉中肌醇的含量至关重要[5]。

目前，有关文献报道的肌醇检测方法多适用于肌醇制剂和保健食品，常用的测定方法有重量法、微生物法、高碘酸钾氧化法、高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）[6-14]等。目前，气相色谱法为食品安全国家标准《食品中肌醇的测定》（GB5009.270—2016)[15]明确规定检测婴幼儿配方奶粉中肌醇含量的标准方法，GC法是将肌醇硅烷化处理后测定[16]，但是由于奶粉中成分复杂，内含有丰富的蛋白质、维生素等营养成分，且会与肌醇一起衍生化，使得奶粉样品中基质复杂，杂质峰会干扰目标化合物的定量，并且会对进样针及色谱柱影响较大，从而影响检测结果的准确性[17]。目前已有研究通过采用固相萃取的方法以达到去除杂质的目的[18]，但其步骤较为复杂，费时。

本研究在国家标准GB5009.270—2016的基础上，利用加入沉淀剂乙酸锌和亚铁氰化钾，去除奶粉中的蛋白质杂质。以期通过优化肌醇测定的前处理过程，找到更为方便、准确的办法解决杂质峰干扰问题。

1 实 验

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

婴幼儿配方奶粉中肌醇定量分析质控样品（中国检验检疫科学研究院测试评价中心），市售婴幼儿配方奶粉。

1.1.2 试剂

三甲基氯硅烷（分析纯）、六甲基二硅胺烷（分析纯）、N,N-二甲基甲酰胺（分析纯）、亚铁氰化钾（分析纯）、乙酸锌（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、正己烷（色谱纯）。

1.1.3 试剂配制

硅烷化试剂：分别吸取体积比为1∶2的三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷，超声混匀。现用现配。（N,N-二甲基甲酰胺、三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷必须保证当三者混合后无白色浑浊现象时方可使用）。

1.1.4 仪器设备

7890A气相色谱仪（配有FID检测器），Agilent；分析天平，赛多利斯科学仪器；超声波清洗器，昆山市超声仪器；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器；离心机，贝克曼；烘箱、恒温热水浴槽，国华电器。

1.2 仪器条件

1.2.1 气相色谱条件

色谱柱：DB-23毛细管柱（60 m×0.25 mm,0.25 μm）；进样口温度：280℃；检测器温度：300℃；分流比：10∶1；进样量：1.0μL；程序升温，初始温度120℃，保持1 min，以10℃/min升到190℃，保持3.5 min，再以35℃/min升到250℃，保持10 min；外标法定量。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

称取1 g样品（精确到0.1 mg）10份于10个50 mL容量瓶中，用12 mL，40℃温水溶解，超声10 min。加入沉淀剂（5 mL亚铁氰化钾和5 mL乙酸锌），用体积分数95%乙醇定容至50 mL，振荡混匀，静置20 min，取10 mL于离心管中，以4 500 r/min离心5 min，取上清液5 mL于旋转蒸发浓缩瓶中。

1.3.2 干燥与衍生

向浓缩瓶中加入10 mL无水乙醇，在85℃下旋转浓缩至近干时再加入5 mL无水乙醇继续浓缩至干燥，转移浓缩瓶至烘箱中100℃烘干1 h。加入10.0 mL N,N-二甲基甲酰胺，超声溶解5 min并转移至25 mL有螺纹盖的离心管中，加入硅烷化试剂3.0 mL并放于80℃水浴中衍生反应75 min。其间每隔20 min取出振荡一次，然后取出冷却至室温。加入5 mL正己烷，振荡混合后静置分层。取上层液3 mL于预先加少许无水硫酸钠的带螺纹盖离心管中，振荡后以4 500 r/min离心，取上清液供气相色谱测定。

1.4 标准溶液配制

1.4.1 肌醇标准溶液（0.010 mg/mL）的制备

称取100 mg（精确到0.1 mg）的肌醇标准物质于100 mL容量瓶中，用25 mL去离子水溶解完全。用95%的乙醇定容至刻度，混匀。取1 mL此溶液于100 mL容量瓶中，用70%的乙醇定容至刻度，混匀。4℃保存。

1.4.2 肌醇标准测定液的制备

分别吸取1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0、20.0 mL肌醇标准溶液于浓缩瓶中，按1.3.2步骤操作。最后得肌醇上机溶液，溶液中所含肌醇的量分别为：0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.20 mg。

1.4.3 沉淀剂的制备

亚铁氰化钾溶液：称取109 g亚铁氰化钾，用水溶解并定容至1 000 mL容量瓶中，混匀。

乙酸锌溶液：称取219 g乙酸锌，用水溶解并定容至1 000 mL容量瓶中，混匀。

1.5 样品的测定

选取市售婴幼儿配方奶粉4份，每份10个样品，按照上述试验1.3.1-1.3.2条件进行测定，外标法定量，分别计算优化前处理方法与国标方法中样品的肌醇含量。

2 结果与讨论

2.1 方法的线性范围与定量

奶粉样品中肌醇代表性图谱如图1。结果表明，在本实验的实验条件下，目标物质前后无明显杂质峰干扰。根据标准曲线步骤测定，以肌醇的量（0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.20 mg）为横坐标，以肌醇气相色谱峰面积为纵坐标，绘制奶粉中肌醇含量测定的标准曲线。

图1 肌醇代表性图谱

图2 肌醇的标准曲线

图2显示，在0.01～0.20 mg范围内，肌醇浓度和肌醇检测色谱峰面积具有良好的线性相关性，r为0.99996。在此浓度范围内，能够实现对肌醇的准确定量检测。在本实验条件下，肌醇的检出限为1.0 mg/100g（3倍信噪比），定量限为3.0 mg/100g（10倍信噪比）。符合婴幼儿配方中肌醇含量检测的要求。

2.2 方法的精密度与回收率

称取1 g（精确到0.1 mg）婴幼儿配方奶粉肌醇质控样品若干份，添加10 mg/100g水平，按照1.3.1-1.3.2的实验条件下进行测定，通过对试样前处理方法进行改进，分析国标法与前处理净化法对分析结果的影响。测定结果见表2，分析图谱见图3。

表2 试样前处理改进对肌醇测定的影响（n=10）

图3 试样前处理改进对肌醇测定的影响

通过表2结果分析可知，两种方法的测量精密度分别为3.2%与2.1%，均小于5%，两种方法的精密度均能达到测定要求，但国标法略低于前处理净化法。两种方法的加标回收率分别为90%～120%与91%～102%，符合实验要求。结果表明，国标法与前处理净化法对样品中肌醇含量测定结果的影响无显著差异，均具有较高的准确性和重现性。并且从图3看，前处理未净化的样品，杂质峰较多，前处理净化组的杂质峰较少，前处理净化具有更好的效果，受样品基质影响较小。

2.3 实际样品测定

采用国标法和本方法（前处理净化法）对样品进行测定，结果见表3（每个结果均为10次平行测定的均值）。

表3显示，采用国标法测定样品中肌醇含量，各次重复测定标准差＜2%；本方法各次重复测定标准差也＜2%；通过对实际样品添加10 mg/100g水平，国标法回收率为96%～103%，本方法平均回收率为95%～99%，本方法测定结果准确性和各次重复测定标准差与国标法相比，没有显著性差异。基于本方法能够除掉样品中大部分蛋白质，更为方便、准确的解决杂质峰干扰问题。并且可以减轻对仪器的损伤，因此可采用本方法测定婴幼儿配方奶粉中的肌醇含量。

表3 2种方法对实际样品中肌醇含量的测定结果（mg/100g）

3 结 论

本研究通过对样品的前处理进行优化，在样品中加入沉淀剂乙酸锌和亚铁氰化钾，去除奶粉中的杂质蛋白质，对试样进行净化处理，浓缩，经硅烷化试剂衍生，正己烷提取，外标法定量，用配有FID检测器的气相色谱测定其肌醇含量。结果显示，本方法能够除掉样品中大部分的蛋白质，色谱杂峰较少，受样品基质影响小，样品检测结果回收率在95%～99%，且各次重复测定标准差＜2%，可以满足奶粉样品中肌醇含量的准确测定；分别采用国标法和本方法对样品中肌醇含量进行测定，结果显示两种方法无显著性差异。适合于婴幼儿配方奶粉中肌醇含量的分析测定。并且改良的气相色谱法完全能够满足婴幼儿配方奶粉中肌醇含量的测定，具有较高的回收率和重现性，更为方便、准确的解决杂质峰干扰问题，提高检测的准确性。