慢性难愈合创面治疗进展

赵斌 褚庆玉 李筱 熊白龙 陈安家

皮肤损伤是再生医学中最具挑战性的问题之一。皮肤创面是由烧伤、割伤、压迫或创伤引起的身体外表面或内表面的损伤。伤口愈合需经过止血期、炎症期、肉芽组织形成期、组织重塑期4个过程[1]；而创面愈合的4个时期是连续进行；创面愈合经过去除伤口处的死细胞和坏死组织，促进伤口床的血管生成，以及诱导再上皮化或完全替代修复表皮的过程。因此，根据伤口愈合的不同阶段，提供不同的治疗策略。随着研究的深入，促进伤口愈合开发一些治疗方法，如生长因子(GF)、干细胞(SC)、高分子支架，组织工程等。准确了解创面的病理学才能解决创面愈合不良的潜在因素，为难愈合伤口的有效治疗提供解决方案。

1 伤口愈合的阶段

1.1 止血期 创伤时，伤口血管收缩使出血减少，血小板与胶原蛋白发生一系列生化反应，血小板释放凝血因子，最后，通过纤维蛋白堵住伤口止血。随着研究深入，水凝胶的问世，被认为是良好的组织工程支架。支架分为可注射支架和不可注射支架。可注射支架，如原位形成水凝胶和胶水，被用于组织工程。多孔支架、网状物等不可注射支架通常适用于骨、软骨等硬组织的工程化。有学者用水凝胶黏附主动脉进行破裂压力试验，复合水凝胶的破裂压力可达160 mm Hg，明显高于动脉血压(120 mm Hg)[2]。此外，复合水凝胶的黏附强度高于壳聚糖/四臂聚乙二醇苯甲酸凝胶，混合水凝胶不但具有较强的黏附力，而且是修复血管的理想材料[2]。同时，水凝胶具有仿生细胞外基质、维持创面湿性环境、促进细胞增殖迁移、降低创面表面温度、促进营养物质扩散和渗透等诸多独特优越的性质，在组织再生、药物控释、创面修复、干细胞移植等生命科学领域展现潜能[3]。

1.2 炎症期 炎症阶段是伤口修复的重要阶段之一，炎性反应不仅是预防伤口部位感染的重要因素[4]，而且是清除凋亡细胞和坏死细胞必要条件[5]。该阶段受细胞和分子信号通路的调节，参与炎症期的细胞中，血小板、巨噬细胞、免疫细胞(如嗜中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞)是最突出的细胞，其中，巨噬细胞是维持宿主稳定的主要细胞，通过增强免疫应答对感染做出反应[6]。巨噬细胞有2种不同表型的炎性细胞：在炎症早期，巨噬细胞激活为促炎型(M1， 又称经典活化的巨噬细胞)；而Th2细胞因子(如IL-4、IL-10和IL-13)则使巨噬细胞极化为抗炎型(M2，又称选择性活化的巨噬细胞)[7]。促炎巨噬细胞因子[如白介素-1(IL-1)，IL-6，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，干扰素-γ]被激活，产生大量促炎介质和细胞因子(IL-1、IL-12和TNF-α)，此外，抗炎介质(IL-1受体拮抗剂和IL-10)促进了抗炎性巨噬细胞的活化以及一些GF的表达，包括TGF-β-1，血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样GF-1。M1型与早期炎症有关，能快速杀灭入侵的细菌、维持组织局部低氧环境，而M2型参与创伤后期组织的修复和重建[8]。

炎性反应在增殖阶段修复中起到重要的作用，但过度和延迟的炎症会导致慢性伤口的形成。因此，炎症调节剂或抗炎策略的应用被提出，以加快创面无瘢痕愈合，局部应用不饱和脂肪酸、纤维支架、含抗炎药(如布洛芬和双氯芬酸)的伤口敷料[9]，以及在伤口部位使用巨噬细胞/单核细胞活化剂葡聚糖[10]。事实上，活化巨噬细胞可以促进纤维化的形成。有学者报道了不同生物材料在输送各种抗炎剂中的应用，各种炎性介质和细胞因子、高分子支架、生物材料作为抗炎药的传递系统已经被再生医学的许多其他研究者报道[11]。高分子支架是可降解生物材料的三维结构，在伤口处释放不同的药物促进创面愈合[12]。

1.3 增殖期 增殖期是伤口愈合过程中另一个重要阶段，皮肤细胞在伤口部位的增殖能力增加，提高创面愈合的效率。在皮肤细胞中，角质细胞的增殖在伤口再生中尤为重要。角质细胞细胞的增殖和终末成熟保持平衡对于伤口愈合至关重要[13]。因此，一种促进伤口愈合策略是促进和维持角质形成细胞的增殖能力[14]与抑制角质形成祖细胞的终末分化[15]被提出。

科学家研究上皮细胞增殖和终末分化调控的一些信号通路，如RHO、ROCK信号通路[16]，信号通路的阻断促进角质形成细胞的增殖。Tiger-17是一种小合成肽以浓度依赖的方式促进角质形成细胞系和人皮肤成纤维细胞的迁移和增殖，成为皮肤创伤的有效治疗。有数据表明，在小鼠全厚创面模型中局部应用Tiger-17可使创面面积由伤后第2天的67.3%减少到第9天的5.9%，因此，促进皮肤细胞增殖或抑制分化为靶点的药物可作为促进创面愈合的一种策略[17]。然而，这些方法的应用，触发了增殖期，应进行机械检查，以确保细胞不癌变。

2 治疗方法

2.1 血管生成的诱导 增生阶段是胶原沉积、组织肉芽生成、血管再生、上皮形成的复杂过程。为加速伤口愈合，通过诱导血管生成促进创面愈合是另一种策略。

血管生成或新血管形成是指从血管网络形成新血管的过程[18]。这种复杂的过程可能是由于伤口部位的低氧状态所致，这对于向人体暴露氧气和营养至关重要。然而，几乎所有慢性伤口都报告了异常的血管生成[19]。促进血管生成已经开发出了不同的方法。研究表明，源自植物和动物的天然成分可用于提高新生血管的形成，以促进慢性伤口的血管生成和创面愈合。例如，胡黄连和芦荟已被证明具有促血管生成特性。这些天然化合物主要通过VEGF、TGF-β-1和bFGF等GF的过度表达来促进伤口愈合[20，21]。此外，动物衍生的成分(例如丝光绿蝇幼虫)已用于伤口闭合[22]，蛆释放一些具有促血管生成特性并能愈合伤口的因子通过上调VEGF表达来促进血管生成[23]。

2.2 促进再上皮化 再上皮化是伤口愈合中的关键，多种细胞共同参与，以实现伤口闭合。该过程中，角质形成细胞在受伤24 h后连续从伤口边缘迁移到伤口床，直到上皮细胞完整覆盖伤口表面。此外，一些GFs如表皮生长因子(EGFs)，角质形成细胞生长因子，趋化因子，细胞因子，角蛋白和细胞外基质化合物在伤口愈合过程中影响角质形成细胞的迁移和增殖[24]。 研究表明，促进上皮再形成可以使急性和慢性伤口创面愈合更快[25]。

Liu等[26]研究了使用毛囊单位促进慢性伤口的上皮再形成，对14例慢性伤口患者取全层头皮真皮移植片；从移植物中分离出毛囊单位，并以4 U/cm2的密度移植到伤口床上。 组织学分析结果以及对临床结果的评估表明，毛囊单位可促进慢性伤口的再上皮化。 最近有学者以山羊毛囊干细胞和真皮细胞为种子细胞，成功构建了具有毛囊器官的组织工程皮肤[27]。为慢性创面治疗提供一种新的治疗方案。

2.3 组织工程 在组织工程中，细胞再生是受损组织修复的重要因素。 在创面修复过程中，角质形成细胞、成纤维细胞是皮肤的主要细胞[28]。角质形成细胞和成纤维细胞是伤口细胞治疗方法中最常见的治疗方法[29]。

皮肤移植为皮肤损伤的治疗提供有活力的皮肤细胞。不同的皮肤移植方法(自体移植和异体移植，特别是自体移植)已经成功地应用于临床。虽然植皮方法具有优越的临床应用价值，却面临着一些困难，如排斥反应、疤痕、感染等问题。因此，皮肤替代品的应用被认为是临床上最有前途的替代和模拟皮肤功能来促进伤口愈合的细胞。皮肤替代物在临床应用中的开发一直是皮肤再生医学和组织工程领域的研究热点[30]。理想的皮肤替代物应具备：抗感染、预防失水、易贮存和长保质期、无排斥反应。

成纤维细胞负责肉芽组织和胶原蛋白的合成，以及伤口愈合过程中蛋白酶和炎性介质的释放。成纤维细胞是适合开发的细胞治疗方法的潜在来源。R&G在1970年代发现了一种将人类角质形成细胞与放射3T3小鼠成纤维细胞培养的方法， 以促进角质形成细胞的生长。结果，产生了角质形成细胞不是很好的自体移植来源，因此被美国食品药品监督管理局视为异种移植物[31]。因此，许多研究已被用于进一步开发R&G的方法以开发不同的培养方法更适合临床使用。有研究使用3种培养基，在分离过程中，与较长的培养时间相比，在高强度胰蛋白酶中的短培养时间导致释放的角质形成细胞干细胞数量增加。

在另一项研究中，Chowdhury等[33]报道了真皮成纤维细胞条件培养基(dermal fibroblasts conditioned medium，DFCM)在人类角质形成细胞培养中的应用。结果表明，DFCM的补充能显著增加角质形成细胞的黏附，添加角质形成细胞无血清培养基(defined keratinocytes serum free medium，DFCM-DKSFM)培养的角质形成细胞附着效率明显高于成纤维细胞特异性无血清培养基(fibroblast-specific serum free medium ，DFCM-FD)和DKSFM培养的角质形成细胞附着效率。此外，添加DFCM-DKSFM和DFCM-FD培养的角质形成细胞的膨胀指数分别是对照组的3.7和2.2倍。

尽管开发了不同类型的皮肤替代品的临床应用，但皮肤替代物的应用仍面临着成本高、效率低、无法完全重建皮肤附件等局限。用于治疗皮肤疾病的培养上皮自体移植片(cultured epithelial autograft，CEA)片还有一些固有的局限性，除培养和制造的程序以外，还面临易碎CEA的储存和处理。此外，在CEA片的临床应用的情况下，一个严重的局限性是要花费较长的时间才能达到适合移植的多层完整的CEA片。作为分化细胞如角质形成细胞的替代方法，间充质SC的应用是一种有前途的细胞学治疗策略[34]。其中间充质干细胞、表皮干细胞、毛囊干细胞、内皮祖细胞是慢性创面治疗最常见的方法。由于SC治疗面临免疫排斥、诱发癌变等缺点[35]。所以，临床中特别关注无细胞治疗战略[36]。SC培养中含有多种活性成分，如干细胞生长因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、角化细胞生长因子(KGF)、胰岛素生长因子(IGF)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、胶原蛋白、透明质酸等多种活性物质，这些活性物质能够影响细胞的存活、增殖、迁移和基因表达，促进组织再生[37]。

然而，SC移植可能与旁分泌调节作用有关，而不是损伤部位受影响细胞的替换。旁分泌是由GF、细胞因子、趋化因子组成，参与信号转导、细胞生长、血管生成和凋亡。旁分泌介导的修复是再生医学的一种新方法，分离和应用特定的SC来源的旁分泌因子可能是一种非常有前途的策略，将旁分泌疗法作为一种新的可行的临床应用[38]。

2.4 GF 在过去的几十年中，GF作为细胞生长、增殖、迁移和其他细胞过程中的关键信号调节因子得到了发展。目前临床上常用的GF包括：表皮生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、血管内皮生长因子[39]。事实上，这些GF在伤口愈合中起着至关重要的作用，包括促进角质形成细胞和成纤维细胞等促进伤口愈合的最重要细胞类型的增殖和迁移；诱导血管生成；抑制炎性反应；刺激肉芽组织形成[40]。尽管GF在创面修复中发挥着重要作用，但其半衰期短、易破裂、价格昂贵等缺点限制在临床的应用。因此，药物传递系统的应用已经被开发用于控制和持续释放GF在皮肤溃疡治疗、烧伤和慢性伤口中的应用[41]。

2.5 高分子支架 许多研究人员已经开发出使用各种支架的方法，这是组织工程的另一个方面，由天然合成或组合生物材料制成的，支架是一种有前途的三维结构，通过模拟细胞周围的微环境提高组织工程方法的效率。这些生物材料系统用于细胞递送、基因递送以及生物活性药物递送已经被开发来恢复或再生有缺陷的组织。此外，许多研究人员已经提出单独将支架皮肤，或支架与GF二者结合用于伤口治疗。目前，临床上依据支架的材料分为：天然支架，合成支架和复合支架。而根据支架使用方法分为可注射支架和不可注射支架，可注射支架如原位形成的水凝胶被用于组织工程。不可注射如多孔支架，网状结构，通常适用于硬组织(例如骨骼和软骨组织)的工程设计。随着研究的深入，理想的支架(合适的机械性能，足够的孔隙率，易加工性，高生物相容性和合适的生物降解率)的问世，将进一步提高再生慢性伤口的能力。

2.6 3D生物打印技术 近年来，3D生物打印技术可以解决供体皮肤受限，为创面修复注入新的动力，成为创伤修复领域新的话题。皮肤的主要细胞是角质细胞、成纤维细胞、细胞外基质(Ⅰ型和Ⅲ型胶原)。有学者将角质细胞、成纤维细胞、胶原做原料材料，用3D生物打印技术制作出模拟天然成分的皮肤，将打印皮肤暴露在气液平面，角质细胞从底层吸收营养成分，不断向表层分化推进形成角质层并不断促进表皮成熟[42]。3D打印技术分为喷光细胞打印和激光细胞打印，而激光细胞打印可以喷出多细胞团，成活率>98%。随着3D生物高精度打印技术的成熟，利用3D 支架将干细胞输送到创面是最有前途的治疗方法。随着干细胞生物学、生物支架制造技术的进步，组织工程技术将成为创面修复再生的治疗措施[43]。

2.7 替代方法(如化学品、植物提取物、负压伤口治疗)

2.7.1 表皮干细胞(keratinocyte stem cells，KSCS):KSCS是促进表皮再生的最重要的表皮细胞[44]。在正常条件下，KSCS一般是静止的细胞群，分裂倾向低，但在损伤时表现出很强的自我更新能力。损伤后，皮肤再生是通过激活伤口处的KSCS来实现的。用一些化学物质或植物提取物预处理KSCS可以加速伤口愈合。有研究从豨莶草植物提取物ent-16β，17-二羟基贝壳杉烷-19-羧酸(ent-16β，17-dihydroxy-19-kauranoic acid，DHK)通过上皮生长因子受体磷酸化刺激KSCS增殖，促进创面愈合[45]。

2.7.2 冷气压等离子体 冷等离子体治疗是治疗伤口的理想方法，因为它具有诱导角质形成细胞增殖，减少细菌种群和刺激皮肤细胞的能力。Hasse等[46]报道使用冷气压等离子体治愈慢性伤口，对慢性创面愈合有积极影响。结果显示在治疗3、5 min 后凋亡细胞增加。值得注意的是，冷血浆暴露1、3 min后，检测到基底角朊细胞的增殖。这些细胞是表皮的再生细胞，这确实有利于伤口愈合，通过检测生长和凋亡分子来研究冷血浆对人皮肤的影响，发现这两个过程都依赖于治疗时间[46]。因此，该方法为冷血浆在慢性创面治疗应用提供了有希望的结果。 此外，冷血浆已成为促进伤口愈合和治疗皮肤病的一种有吸引力的工具，冷大气压等离子体射流(atmospheric-pressure plasma jets，APPJs)在伤口愈合中亦可应用[46]。结果显示，与对照组相比，APPJ治疗10、20、30、40 s后的伤口每日改善显著增强，分别在第12、10、7、13 d几乎完全愈合。第7天观察表皮细胞再生、肉芽组织增生和胶原沉积在组织学方面的最佳结果。治疗50 s的伤口在第14天的愈合不如对照组。适当剂量的冷血浆可使创面周围细菌失活，促进成纤维细胞增殖，加速创面愈合。然而，过量的血浆抑制了由于细胞凋亡或坏死而导致的伤口愈合。正、负效应可能与APPJ中活性氧和氮物种(ROS和RNS)的存在有关[47]。

2.7.3 负压创面治疗(negative pressure wound therapy，NPWT) 是20世纪90年代末出现的一种治疗慢性创面的方法。广泛应用急性创伤、糖尿病足、伤口感染、难愈合性创面，取得了良好的临床效果。NPWT诱导的细胞形变有利于血管的生成和有丝分裂，此外，NPWT具有清除多余液体和细菌负荷、促进局部灌注的能力，有助于加速伤口边缘组织的再生修复。NPWT不但能有效的防治伤口感染、促进伤口愈合，还能促进慢性难治伤口的愈合、减少住院费用、节约医疗资源[48]，智能负压的出现，给NPWT的治疗提供广泛的空间，为临床各类创面的治疗提供技术保障。

2.7.4 中医中药 传统中医药学对慢性难愈合性创面的治疗由来已久，且治疗效果疗良好，积累许多的方法及经验，如煨脓生肌、祛腐长肉、活血化瘀等。湿润暴露疗法和美宝湿润烧伤膏是一种中医药外用治疗方法，经过近三十年的实验研究及临床应用，广泛运用于临床体表慢性难治性伤口的治疗[49]。有学者研究指出，艾灸联合湿性愈合疗法，缩短难愈合性伤口的愈合时间，减少换药次数，减轻患者的痛苦，加速患者的整体康复水平[50]。

随着各种治疗方法的发展，治疗难愈合性创面取得一定的成就，但慢性难愈合性创面的治疗仍然是具有挑战性的问题。随着再生医疗技术的不断发展，具有抗炎、抗凋亡和血管生成作用的支架和(或)GF联合应用，促进角质细胞的增殖，加速上皮细胞迁移，缩短创面愈合时间，降低住院费用。