CEST成像在生物工程中的应用进展

胡彦兵 马海鸿 郑永涛 徐 锋

Forsen和Hoffman两位学者首次采用双共振核磁共振（nuclear magnetic resonance， NMR）方法开放地检测到化学交换的中间产物，并就此开辟了新领域——化学饱和交换转移（chemical exchange saturation transfer， CEST），这是一个测量稀释大分子物质之间的化学交换和化学动力学的敏感方法[1-2]。CEST可以行多种化合物（葡萄糖、糖原、乳酸盐）、蛋白质和酶的分子成像。CEST成像不仅对不稳定的质子浓度、交换速率、pH和温度敏感，还受到弛豫率、场强、射频功率、成像参数等因素的影响。发展外源性CEST试剂，包括顺磁性CEST试剂和逆磁性CEST试剂可以极大地提高CEST成像的敏感度。此外，CEST成像能够应用于干细胞示踪，肿瘤细胞追踪，测定pH、温度、体内酶活性和组织代谢等[3-11]。此文对CEST成像在生物工程中的应用作一综述。

EST对比剂分类

CEST是一类阴性磁共振成像对比剂，通过转移饱和质子达到减低水质子的信号而产生阴性对比。与传统的T1或者T2磁共振对比剂不同的是，CEST对比剂具有很高的敏感性和特异性，而且它可以通过特定的刺激开启，如pH、温度和饱和脉冲等[12-14]。目前研究中使用的CEST对比剂基本可以分为三种类型：①顺磁性CEST试剂，这类对比剂主要是以镧系元素为核心合成的对比剂，敏感性比较高[15-16]。镧系元素往往具有毒性，因此目前这类对比剂多用于动物实验中；②逆磁性CEST对比剂，主要是包括酰胺基、胺基或者羟基的小分子化合物，如糖原、蛋白质、多肽等，敏感性稍低[17]。这类对比剂多是天然存在的或者人体本身具有的化合物，因此有望广泛应用于临床。更重要的是，由于某些大分子物质就存在于人体内，可以作为内源性对比剂，更加安全和方便。③新型合成对比剂，如脂质体、多聚赖氨酸、介孔二氧化硅等。这类对比剂由于本身含有较多的可交换不稳定质子群，也具有比较高的敏感度，而且其本身是利用有机物合成的，不含毒性，因此有更为广阔的应用前景[18-20]。

CEST对比剂的应用

1.干细胞示踪

干细胞移植治疗多种疾病已经得到了全世界范围内的关注，并且已经得到了临床方面的应用。2017年，《新英格兰医学杂志》杂志同时报道了世界上两个不同中心应用干细胞移植治疗视神经病变，虽然目前疗效仍不稳定，但是为这些难治性疾病提供了可能的解决方案[21-22]。然而，在干细胞移植治疗应用于临床前，必须建立无创性的体外示踪方法去示踪干细胞在体内的迁移、分布、功能重建等。尽管磁共振技术和PET等技术已经为干细胞示踪提供了很多途径，这些技术仍有其自身难以克服的缺点，如示踪剂的生物毒作用、难以长期示踪等，CEST技术则为干细胞示踪提供了一个新的思路。Pumphrey研究组[23]将Eu-HP-DO3A标记的心肌干细胞分别移植到实验组（同种系小鼠）和对照组（异种系小鼠），并在移植后持续使用MRI示踪20天，结果显示实验组持续检测到CEST信号，而对照组的CEST信号逐渐消失。顺磁性CEST试剂主要是通过胞饮作用进入细胞内，因此需要在移植前将对比剂与移植细胞共培养。与常规MRI示踪技术不同的是，CEST-MRI可以根据示踪剂分子的不同选择不同的预饱和脉冲，因此可以实现同时示踪两种不同的细胞。在Nicholls等[24]的研究中，他们分别使用Yb-HP-DO3A和Eu-HPDO3A标记移植的内皮细胞和神经干细胞，然后移植到卒中小鼠模型脑内，通过使用不同的预饱和脉冲，可以同时示踪到这两种细胞。虽然使用顺磁性CEST试剂标记移植细胞具有很高的敏感性，但镧系金属的毒性限制了它在临床上的使用，因此我们应该开发更多的逆磁性CEST试剂标记干细胞的方法和技术，以期早日实现该技术的临床应用。

2. pH 的测定

由于交换速率与组织微环境的pH直接相关，CEST效应对pH变化敏感，因此CEST技术被用于检测体内pH。肿瘤灶内常有细胞缺血坏死，且肿瘤细胞糖代谢紊乱，pH不同于正常细胞。恶性肿瘤的细胞外pH明显低于周围正常组织，因此检测pH对于肿瘤性质的判定具有重要意义。特别是在某些低级别肿瘤中，常规的磁共振很难将其与炎症等疾病区别开来，CEST技术通过测定pH有助于肿瘤性质的判断。Yb-HP-DO3A是一种顺磁性CEST对比剂，其上的两个羟基可以产生CEST效应，通过数学公式换算，可以得到其CEST效应和一定范围内的pH呈线性相关关系[15]。然而，这个pH范围通常位于5.2～6.7，而一般肿瘤的pH多位于6.4～7.2之间，因此使用价值有限。碘帕醇是一种临床常用的CT显影剂，作为顺磁性CEST试剂，碘帕醇也可以用来测定体内pH。碘帕醇具有两个可转移的质子，其预饱和脉冲分别是4.3ppm和5.5ppm，因此，在同一时间内可以分别施加不同的预饱和脉冲，然后通过数学计算公式，消除浓度等其他方面的影响，定量检测体内pH。目前研究发现在一定范围内（5.5～7.5），碘帕醇的CEST效应和pH呈线性相关关系，可以用于肿瘤的辅助诊断[17，25]。有学者通过将CEST-MRI和PET联合应用，证实了CEST-MRI探测到的低pH 区域确实存在高代谢情况[26]。

除了探测肿瘤的pH外，CEST技术还可以通过检测移植细胞的pH用于判断示踪干细胞移植后存活状态。细胞的存活与局部微环境pH密切相关，因此我们可以通过检测移植细胞微环境的pH判断细胞的存活状态。Chan等[18]利用具有CEST效应的赖氨酸构建了一个脂质微囊，在微囊内部注入干细胞，即刻检测pH在正常范围内，随着细胞的凋亡，pH出现降低。Ni等[19]将金属镉离子和赖氨酸有机结合起来，构建了一个既能在T1显像又具有CEST效应的纳米微粒，该微粒不仅可以提供移植细胞的位置分布，还能同时探测pH。CEST的pH成像技术在脑卒中方面也显示了很好的应用前景，急性期或超急性期pH-MRI可反映核心坏死区和半暗带区域的pH，提供更为准确的半暗带区域。不仅能够帮助探讨更深入的分子机制，还可用于指导脑卒中临床治疗和预后评价。

3. 温度的测定

温度也是机体代谢的一个重要参数，和人体的代谢、酶的活性密切相关。既往研究已报道利用磁共振无创性探测体内温度，最常用的方法是利用温度和磁共振T1弛豫时间，化学位移或者自由水的扩散系数之间的关系。然而，这种方法的低灵敏度限制了它的应用。因而，有研究报道利用顺磁性CEST试剂的MRI效应与温度的关系来探测温度。顺磁性CEST试剂上的酰胺质子和自由水的质子之间的转移是温度依赖性的，而且对温度变化非常敏感，因此我们可以使用CEST-MRI无创性检测体内温度[13，27]。Nevin等[13]发现在pH6.0～8.0范围内，Tm3+-DOTAM上的酰胺质子和自由水质子之间的转移速率和温度成线性相关关系，而且探测敏感度较高。使用一定的数学方法以后，可以得到CEST效应和温度的曲线关系。

4. 体内酶活性测定

利用CEST技术测定酶的活性的原理是酶可以改变CEST试剂的结构，从而增强或者降低CEST效应，造成可探测到的CEST-MRI的改变。目前可以利用的有两个方面。一是CEST对比剂注入生物体内后，通过在体外检测CEST信号的改变来反应酶的活性。Liu等[28]提出了一个在体外检测胞嘧啶脱氨酶（CDase）的活性的CEST-MRI方法，该酶是催化胞嘧啶脱氨酸尿嘧啶的酶。他们的研究结果表明，胞嘧啶脱氨酶的两个底物，胞嘧啶和5-氟胞嘧啶（5FC）可以分别使用+2ppm和+2.4ppm（相对于水）的预饱和脉冲来检测。在这两个代谢底物被胞嘧啶脱氨酶脱氨后，CEST效应就会消失。因此，可以用高分辨率CEST-MRI成像在体外检测胞嘧啶脱氨酶的活性。CEST-MRI有可能在活组织中实时跟踪多种酶的动力学。二是检测移植细胞内报告基因的表达。将报告基因通过病毒转染的方式插入移植细胞内，当报告基因在受体内表达酶时，通过检测底物的CEST效应的改变来间接反映该报告基因的表达情况[21]。

5. 组织代谢的测定

葡萄糖是生物体代谢和维持生命活动最主要的功能物质，葡萄糖代谢异常会引起多种疾病。此外，肿瘤组织的葡萄糖代谢也与正常组织不同，因此检测葡萄糖在体内的分布有助于判断生物体的代谢状况。Zhang等[20]利用苯基硼酸可以和羟基可逆性结合的特点将CEST试剂(EuDTMA-2PB3+)结合在了葡萄糖上面，通过在体外利用MRI检测EuDTMA-2PB3+的CEST效应和峰值变化，就可以得知葡萄糖在体内的代谢状况。同样，Ren等[31]学者将连接了EuDTMA-2PB3+的葡萄糖和EuDTMA-2PB3+分别注射到实验组和对照组中，在体外施加42ppm的预饱和脉冲以后，MRI检测发现实验组的CEST信号较对照组下降了17%。这说明该方法可以用于检测葡萄糖在体内的分布。

总结和展望

综上所述，与常规T1、T2 MRI不同的是，CEST-MRI具有较高的敏感性、对比剂广泛、不仅可以示踪位置还可以示踪功能等优点，这使得CEST-MRI具有较大临床应用前景。但是目前还有一些问题需要解决：①外源性对比剂较内源性对比剂有着更高的敏感度性，但是其生物毒性仍然是限制其使用的重要原因；②在以后的工作中，应该进一步完善相关序列的设置，使得CEST技术应用更加方便；③虽然CEST技术可以在体外检测体内的pH、温度等，但是需要进行严格的数学计算，因此优化数学模型至关重要。相信随着研究的深入和更多CEST对比剂的开发，CEST技术一定会在临床上有更大的应用前景。