线粒体损伤在急性胰腺炎发病机制中的作用

吴英珂，王卫星

（武汉大学人民医院 普通外科，湖北 武汉 430060）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一种由多种病因引起的胰酶异常激活后导致胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症性疾病，多数患者病情表现较轻，但仍有20%～30%患者可进一步发展为重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP ），SAP患者通常伴有一个或多个器官功能障碍[1]。AP炎症过程中细胞损伤的发病机制仍未完全阐明，临床上尚缺乏有效的治疗方法。线粒体是细胞ATP合成的重要场所，近年来研究[2]表明线粒体损伤是AP发生发展的中心环节。目前研究多认为钙超载作为起始病理过程导致腺泡细胞内线粒体损伤，进而导致细胞能量代谢障碍。随后线粒体损伤与ATP耗竭、线粒体通透性改变、自噬损伤等多种病理机制介导腺泡细胞损伤和坏死，触发炎症反应[3-5]。此外AP的病情与坏死程度直接相关，而线粒体在调控细胞凋亡坏死平衡中具有重要作用。因此对线粒体损伤在AP发展过程中的基本病理机制进行深入探讨可为临床上AP的治疗开辟新的途径。

1 正常腺泡细胞线粒体功能与分布

线粒体是真核细胞内由内膜和外膜两部分组成的细胞器，由外到内分为外膜、膜间隙、内膜以及基质4 个功能区。线粒体内膜向内凹陷形成嵴，包含呼吸链蛋白和各种酶系，在膜间隙和基质之间形成相对不渗透的屏障；外膜具有孔蛋白构成的亲水通道，对离子和小分子的通透性较高[6]。线粒体的主要功能是为细胞提供各种功能活动所需要的能量。此外，线粒体还是细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生的主要来源，并且在细胞氧化应激、细胞内Ca2+稳态、细胞凋亡中均有重要调控作用[7]。

胰腺腺泡细胞中有3组不同的线粒体，分别是位于颗粒区和基底外侧区之间边界上的粒周线粒体，靠近质膜处基底外侧区的外周（或质膜下）线粒体，和围绕着细胞核的核周线粒体[8]。3组不同的线粒体在细胞内Ca2+稳态的调节中起着不同的作用。粒周线粒体防止Ca2+信号扩散到细胞的基底区，将生理Ca2+信号限制在顶端区域[9]。外周线粒体在局部为Ca2+泵介导的内质网摄取Ca2+提供所需的ATP，并且有充分的证据表明线粒体功能在钙库操控性的钙内流中起着至关重要的作用[9-10]。而核周线粒体作为细胞核的保护屏障，使细胞核免受Ca2+信号的入侵[8]。

2 线粒体钙超载

最近研究[11]表明线粒体损伤和ATP耗竭在AP的发生发展中起着重要作用。而腺泡细胞内Ca2+浓度病理性升高是AP发病早期的标志性事件[12]。胆汁酸和非氧化乙醇代谢物可导致内质网中的Ca2+释放，并激活腺泡细胞膜上的钙释放激活钙通道蛋白1（ORAI1）诱导细胞外Ca2+内流[13]。细胞内Ca2+浓度的持续升高导致线粒体Ca2+超载和细胞内ATP生成减少[14]。在这种情况下粒周线粒体不能缓冲顶端Ca2+浓度的升高，导致局部的Ca2+信号扩散到整个腺泡细胞[15]。由于ATP是肌浆内质网Ca2+-ATP酶（sarco-endoplasmic reticulum Ca2+pump，SERCA）和质膜Ca2+-ATP酶（plasma membrane Ca2+ATPase，PMCA）清除胞浆中Ca2+所必需的[16]，ATP生成的降低会损害细胞内Ca2+清除能力，从而进一步促进了胞内Ca2+的持续升高。持续的Ca2+超载导致线粒体膜通透性改变和线粒体损伤，这种恶性循环最终导致腺泡细胞坏死。因此，抑制或消除钙超载的毒性作用是AP的一个潜在治疗靶点，而Orai1通道的小分子抑制剂是目前治疗AP最有前途的药物之一[17]。Waldron等[18]应用ORAI1通道抑制剂CM4620减轻了AP小鼠和人腺泡细胞的坏死。目前该药已完成第一阶段临床试验，将进入第二阶段临床试验以评估其在AP患者中的安全性和有效性[12]。

3 细胞内ATP 耗竭

Maléth等[19]在离体豚鼠胰腺导管上皮细胞中观察到高浓度的非结合胆汁酸引起线粒体的形态学损伤和随后的ATP耗竭。此外，他们还发现ATP耗竭可直接抑制胰管碳酸氢盐和液体的分泌。在膜片钳全细胞记录中通过增加贴片移液管中ATP的浓度可以在体外补充细胞ATP。Judák等[20]通过贴片移液管在细胞内给予5 mM ATP降低了乙醇、棕榈油酸、棕榈油酸乙酯对分离豚鼠胰腺导管上皮细胞中囊性纤维跨膜调控因子（cystic fibrosis transmembrane regulator，CFTR）氯离子通道的抑制作用。Booth等[21]用同样的方法补充ATP阻止了牛磺胆酸硫酸盐（TLC-S）导致的腺泡细胞内Ca2+的持续升高和坏死。这些研究提示体外补充ATP可以防止AP时腺泡和导管细胞的功能障碍和损伤，然而这种方法仍只能停留在实验研究阶段。一项多中心双盲随机对照临床研究[22]表明，通过早期高热量肠内营养来维持ATP生成对AP患者来说是必要的。此外，近年来临床对肠道唤醒作用的重视使得肠内营养成为AP治疗过程中的关键一环[23]。

4 线粒体膜通透性改变

线粒体通透性转换孔（mitochon drial permeability transition pore，MPTP）是位于线粒体内膜上的对环孢菌素A敏感的高电导通道，由Ca2+激活。一旦被激活，它允许小于1500 Da溶质和水在线粒体内膜上非选择性扩散[24]。MPTP形成的具体分子机制还未完全明确，最近有研究[25-26]表明F0F1ATP合成酶参与MPTP的形成。MPTP有一过性开放和持续性开放两种开放状态。前者被认为是生理性的，通过在线粒体基质和信号传导所需的细胞质之间快速交换溶质（例如Ca2+，氧自由基）来发挥生理作用。而持续性的开放则是病理性的，导致线粒体膜电位丧失，活性氧释放，细胞Ca2+稳态受损，线粒体肿胀，以及促凋亡因子释放到细胞质中以引发细胞死亡[24]。这两种功能均受亲环素D的调控[27]。

胰腺炎致病因素通过第二信使受体三磷酸肌醇（inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor，IP3R）引起钙的异常释放，从而使对钙信号敏感的胰腺腺泡线粒体超载，进而引起高电导MPTP的持续开放和膜电位丧失，导致ATP生成崩溃和随后的坏死[28]。而在小鼠或人胰腺腺泡细胞，药理性或遗传性地抑制MPTP对AP中的膜电位丢失、ATP生成障碍和坏死有保护作用[28]。这一机制在雨蛙素诱导、TLC-S诱导、脂肪酸乙酯诱导和氨基酸诱导胰腺炎等多种AP模型中得到证实，在亲环素D基因敲除小鼠和给予PMTP抑制剂TRO40303的野生型小鼠中典型的病理反应明显减轻[28-29]。此外，另一研究[30]显示亲环素D小分子抑制剂也能通过保护线粒体减轻小鼠和人腺泡细胞的坏死，改善AP的严重程度。综上所述MPTP是AP治疗的一个潜在药物靶点，然而无论是TRO40303还是亲环素D抑制剂都需要进一步的临床试验以验证其临床有效性。

5 腺泡细胞自噬受损

生理条件下，大自噬通过自噬体形成，及随后的自噬体与溶酶体融合来降解衰老、受损的细胞器，从而对腺泡细胞发挥保护作用[31]。而当溶酶体相关膜蛋白（LAMPs）降解导致自噬受损时，大量异常增大的含有未消化降解物质的自噬体堆积，导致腺泡细胞酶原颗粒的降解效率降低和酶原激活[32-33]。自噬效率降低主要表现为胰腺的自噬标记物LC3-II和自噬底物p62/SQSTM1水平的增加，泛素化蛋白积累增多[34]。AP中溶酶体蛋白水解功能下降的一个特点是组织蛋白酶的加工成熟缺陷，尤其是关键的组织蛋白酶B（cathepsin B，CTSB）。有研究[35]发现在L-精氨酸（L-Arg）诱导AP 模型中，亲环素D 基因敲除不仅恢复了CTSB的加工成熟，而且使自噬通量正常，导致LC3-II、p62和泛素化蛋白水平下降和腺泡细胞空泡化的明显减少。为了进一步证实AP中线粒体与自噬损伤的关系，研究者使用GFP-LC3小鼠与亲环素D基因敲除小鼠杂交的小鼠，亲环素D在GFPLC3小鼠体内的消融几乎完全阻止了Arg-AP诱导的内源性LC3-II和GFP-LC3-II的积累[28,35]。另有研 究[36]表明，Arg-AP激活的线粒体自噬同样被亲环素D基因敲除所阻止。亲环素D敲除使自噬正常化提示自噬受损可能是线粒体损伤的关键下游效应。

近年来的研究显示调控自噬的药物可能对AP的治疗具有意义。应用海藻糖使Arg-AP模型中的自噬活性增强后，小鼠的胰腺炎反应明显减轻，且胰蛋白酶原的活化被完全阻止[35]。此外，BRD4和成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）均能通过上调SIRT1来恢复自噬通量，从而减轻小鼠AP严重程度[37-38]。番茄红素可通过调节自噬来减轻小鼠的AP严重程度，然而需要更多的研究来确定其具体机制以及其对人类胰腺炎的预防和治疗作用[39]。临床回顾性研究显示他汀类药物可降低AP的发病率及改善预后[40-41]。而在大鼠AP模型中，辛伐他汀通过诱导自噬体与溶酶体融合恢复了自噬通量，从而减轻了线粒体损伤和AP炎症反应[42]。辛伐他汀在临床应用中具有安全性，然而其在AP患者中的有效性还有待临床试验来验证。线粒体损伤和自噬受损都是AP发生发展中的关键环节，进一步研究两者间具体分子机制与联系并使这些途径正常化有助于找到AP的潜在治疗方法。

6 AP 中细胞死亡的线粒体机制

线粒体除了提供能量，还在细胞死亡的调控中起着核心作用，包括细胞凋亡和坏死[6]。线粒体调节细胞死亡的核心作用主要通过线粒体膜通透性（mitochondrial membrane permeabilization，MMP）来实现。线粒体膜通透性触发凋亡和坏死途径的主要形式分别是线粒体驻留蛋白细胞色素C释放进入胞质和线粒体去极化。线粒体去极化由MPTP介导，导致膜电位丧失并最终引起ATP耗竭和坏死。而线粒体外膜通透性（mitochondrial outer membrane permeability，MOMP）系统调控细胞色素C的释放，细胞色素C可与凋亡蛋白酶激活因子1和凋亡蛋白procaspase-9相互作用，形成凋亡小体并激活procaspase-9。caspase-9依次激活效应物caspase例如caspase-3，进而介导下游的凋亡事件[43]。因此，线粒体中的MMP是调节细胞两种死亡途径的中心环节。

腺泡细胞死亡是AP 的主要病理反应之一，在AP过程中，腺泡细胞同时发生坏死和凋亡。值得注意的是，动物模型中AP的严重程度与坏死程度成正比，与凋亡程度成反比[44]。此外，刺激腺泡细胞凋亡可减少坏死和AP的严重程度，而应用caspase抑制剂抑制凋亡则坏死加重[44]。经典的MPTP开放的一个关键特征是线粒体肿胀，导致线粒体外膜破裂。而胰腺MPTP具有与典型MPTP不同的性质特点，Ca2+诱导的离体胰腺线粒体去极化与肿胀和线粒体外膜破裂无关[45]。此外，Ca2+诱导的去极化使胰腺线粒体中的ROS显著降低[45]，而肝和其他器官线粒体中的MPTP开放则导致ROS大量释放。研究[46]表明ROS氧化心磷脂可促进细胞色素C脱离，增加细胞膜间隙细胞色素C水平从而引起释放。因此，由于胰腺MPTP的特殊性，其内存在一种负反馈调节，即线粒体去极化抑制细胞色素C的释放。这种负调控机制的影响是膜电位的丢失不仅介导坏死，同时也会抑制细胞凋亡。由此可见，胰腺炎腺泡细胞的死亡方式是在线粒体水平上通过Ca2+、膜电位水平和ROS的相互作用来调控的[47]。

此外，Bcl-2家族蛋白也是细胞死亡的重要调控因子，尤其是对凋亡的调控，它们通过调节线粒体外膜通透性，介导细胞色素C释放到胞质中来发挥作用[48]。对分离的线粒体和腺泡细胞的研究表明，上调蛋白Bcl-XL和Bcl-2的表达通过防止线粒体去极化和随后的ATP耗竭防止胰腺腺泡细胞坏死[49]。此外，研究显示高压氧疗法通过诱导AP大鼠caspase依赖的凋亡减轻AP严重程度，其机制可能是通过Bcl-2家族成员调控线粒体凋亡途径[50]。缺氧诱导因子1α基因敲低通过维持线粒体稳态改善细胞内能量应激，减轻坏死促进凋亡，从而降低AP炎症反应[51]。靶向线粒体对细胞凋亡与坏死的平衡进行调控可能是AP的一个潜在治疗策略。

7 总结与展望

AP的病理发展机制是由多种因素介导的复杂生物学过程，而线粒体损伤在其中的作用越来越受到关注。钙超载、ATP耗竭、线粒体膜通透性改变、自噬受损等在AP病理发展过程中互相影响，而作为细胞能量供应中心，线粒体的损伤始终贯穿在这些病理机制中，深入探讨其与各个环节之间的具体机制，有助于找到新的临床上治疗AP的方法。此外，线粒体对细胞死亡途径的调控也在AP中发挥着重要作用，然而线粒体是否可以作为靶点在临床上治疗AP仍需要更进一步的探究。