不同源性外泌体在骨缺损修复中的研究进展

刘士博 刘显

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院口腔颌面外科，成都 610041

肿瘤、创伤导致的骨生成不足及骨愈合不良，常造成患者生活质量降低，治疗时间延长，给临床治疗带来了巨大挑战[1-2]。目前临床修复骨缺损的金标准是自体骨移植，自体骨具有良好的生物相容性和临床安全性，但同时面临移植骨量有限、增加手术创伤等问题[3]。如何有效修复骨缺损，避免上述并发症成为临床亟待解决的问题。

骨损伤最初阶段为炎症反应，炎性细胞及炎性因子促进干细胞募集、增殖并进一步分化为终末细胞（骨细胞等）及非骨形成细胞（纤维细胞等），进而促进骨组织形成[4-5]。上述成骨过程涉及骨微环境中的多种细胞，如树突状细胞（dendritic cell，DC）、干细胞、成骨细胞（osteocblast，OB）、内皮细胞等，这些细胞相互影响、相互调节，进而促使骨修复重建，然而细胞间信息如何相互交流的具体机制仍未得到明确解释[6]。传统理论认为，细胞可分泌细胞因子，通过旁分泌途径进行细胞间信号交流，而多数细胞因子体内半衰期较短（如转化生长因子-β1激活后体内半衰期仅2 min），作用半径很小，无法有效进行远端传递，而远端骨损伤时存在干细胞募集趋化行为[7]，推测骨缺损修复过可能存在某种细胞间通讯方式，促进骨微环境中的细胞信号传递从而促进骨组织形成。外泌体（exosome）作为旁分泌途径的重要媒介，是细胞间交流和遗传物质转运的重要介质，在骨损伤修复过程中发挥着重要作用，在组织工程中受到越来越多的关注。本文综述了不同细胞来源外泌体在骨缺损修复中的重要作用，以期为外泌体应用于骨组织工程促进骨修复提供帮助。

1 外泌体生物学特征

外泌体是细胞外囊泡的一种亚型，可由多种细胞分泌，如DC、干细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等，广泛分布于血清、尿液、唾液及其他体液中。分离提取外泌体主要有超速离心法、超滤法、试剂盒提取等方法[8]。

外泌体起初被认为是细胞代谢排泄的废弃物，随着研究[9]发现，其对细胞间信号传递也有着至关重要的作用。外泌体内容物多种多样，并根据其源细胞不同而存在差异。外泌体可在细胞之间传递抗原呈递分子、RNA、蛋白质完成细胞间通讯，进而调节靶细胞的功能及活性[10]。研究[11]表明，受体-配体的相互作用在这一过程中起到了重要作用，外泌体可以通过跨膜蛋白直接与靶细胞信号受体相互作用，或与受体质膜融合将内容物递送到胞质中，也可内化至受体细胞中从而发挥相应生理作用。

2 不同细胞源性外泌体与骨修复

2.1 DC源性外泌体与骨修复

大量临床和实验研究[12]揭示了炎症反应与骨缺损修复的紧密联系：骨缺损修复需要炎症反应的有效控制，过度的炎症反应可加速骨组织的破坏与吸收。免疫细胞参与抗原识别、特异性免疫应答，对炎症调节有重要作用，而DC作为免疫细胞的重要组成，其如何参与炎症调节，促进骨缺损修复也逐渐受到关注。研究[13]表明，DC源性外泌体可抑制T细胞增殖从而延迟胶原诱导的小鼠关节炎的发作。DC可通过分泌外泌体携载抑炎因子miR-155及抗炎因子miR-146a作用于T细胞等免疫细胞，从而调节炎症反应[14]。DC源性外泌体除参与调节炎症反应外，还可作用于间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），促进骨修复再生所需活性因子的分泌，从而使骨向分化顺利进行。Transwell实验显示DC源性外泌体可促进骨髓MSCs的迁移和募集，内容物检测其含有骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、基质金属蛋白酶-9（matrix metal loproteinase-9，MMP-9）、白细胞介素（interleukin，IL）-5等多种募集因子[15]。DC源性外泌体与MSCs共培养后，碱性磷酸酶（alka line phosphatase，ALP）及Runt相关转录因子2（Runtrelated transcription factor 2，Runx2）等成骨相关蛋白表达显著增加，MSCs表现出成骨向分化[16]。

2.2 干细胞源性外泌体与骨修复

干细胞除自身定向成骨分化，还可通过旁分泌途径促进骨再生，而外泌体作为重要的旁分泌介质，对骨缺损修复有着至关重要的作用。

Liu等[17]发现，系统性红斑狼疮小鼠模型中，移植的MSCs源性外泌体可传递Las至受损骨髓MSCs而提升其功能，从而改善骨质疏松表型。研究[18]表明，经成骨诱导后的骨髓MSCs分泌的外泌体与未经诱导的骨髓MSCs共培养后，后者骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、锌指结构转录因子（osterix）、OPN等成骨相关蛋白表达显著上调，表现出骨向分化。骨髓MSCs源性外泌体可减少骨髓MSCs凋亡及DNA损伤，促进骨髓MSCs增殖，降低骨髓MSCs的放射性损伤[19]。另外，CD9-/-小鼠产生的外泌体数量较野生型小鼠少，骨折愈合速度显著降低，而注射MSCs源性外泌体后，骨折愈合能力得到显著提升[20]。经成骨诱导后的MSCs源性外泌体可以促进血管及新骨形成从而修复骨质疏松大鼠颅骨缺损[21]。

骨髓MSCs源性外泌体对OB的成骨分化同样发挥重要作用。PKH67标记的骨髓MSCs源性外泌体与OB共培养后，细胞中高尔基体、内质网及溶酶体等细胞器内广泛检测到已标记的外泌体，并且ALP、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、OPN及Runx2等成骨相关蛋白表达显著上调，表明骨髓MSCs分泌的外泌体可以通过内化方式被OB内吞并促进其成骨分化[22]。炎症状态下，脂肪干细胞源性外泌体可促进OB的增殖和骨向分化[23]。

干细胞源性外泌体很大程度上是通过其携带的mi-RNA发挥成骨作用。Qin等[22]发现，miRNA抑制剂可显著减弱骨髓MSCs源性外泌体介导的OB向分化，表明miRNA对外泌体促进骨形成有重要作用，研究还发现骨髓MSCs源性外泌体携载的miR-196a、miR-27a及miR-206三种miRNA在诱导干细胞成骨分化中发挥主要作用。另外，MSCs源性外泌体携载的miR-191、miR-222、miR-21可促进细胞增殖，miR-10b可促进细胞迁移，miR-129、miR-136可调节血管形成[24-26]。

干细胞源性外泌体在促进成骨作用的同时，还可以协助调节炎症反应。MSCs可通过外泌体传递microRNAs以促进巨噬细胞对线粒体的循环利用而加强其抗炎活性[27]。骨髓MSCs源性外泌体可作为免疫调节介质，调节T细胞的成熟、凋亡与增殖[28]。

2.3 OB源性外泌体与骨修复

OB作为骨微环境的重要组成，可通过分泌外泌体参与调节成骨-破骨平衡。矿化的OB源性外泌体可促进骨髓基质细胞成骨相关miRNA的分泌，如miR-1192、miR-680及miR-302a，下调其轴抑制因子（axis inhibition，Axin）1的表达并促进β-连环蛋白（β-catenin）表达，促进其成骨向分化，进而促进骨组织再生[29]。另外，OB前体细胞可分泌含矿化调节因子转化生长因子β受体Ⅱ相互作用蛋白1（transforming growth factor beta receptor Ⅱ interacting protein 1，TRIP-1）的外泌体，促进细胞外基质矿化及骨组织形成[30]。

另有研究表明，OB可以通过分泌含核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of NF κB ligand，RANKL）的外泌体作为媒介促进破骨细胞（osteoclast，OC）形成。甲状旁腺激素可诱导成骨细胞分泌大量携载RANKL的外泌体，此外泌体与RAW264.7细胞共培养后可促进OC形成，另外，NFATc1可通过去磷酸化并转移至细胞核从而促进OC的形成和活化，是RANKL诱导OC形成的主要调节因子，而上述OC形成过程中检测到NFATc1发生核易位；荧光标记显示外泌体与RAW264.7细胞表面结合，从而进一步诱导上述过程[7]。

2.4 OC源性外泌体与骨修复

骨代谢主要依靠OB的成骨分化与OC的破骨功能相互作用，达到修复骨缺损的目的，因此，在加强成骨作用的同时，如何调节OC功能也十分重要。研究表明，OC源性外泌体表面核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）被消耗后，其对OC分化的抑制作用得到明显缓解，表明OC源性外泌体可通过RANK-RANKL信号途径调节破骨细胞分化[31]。另外，研究[32]发现，OC源性外泌体表面蛋白ephrinA2可以靶向结合OB表面受体EphA2而抑制OB活性。miRNA-214与骨改建密不可分，在骨折的老年女性以及骨质疏松大鼠血清中，miRNA-214含量较正常情况下显著增高。Li等[33]研究表明，OC可分泌外泌体携带miRNA-214作用于OB，抑制其成骨及矿化活性，miRNA-214活性抑制后，其抑制成骨的作用随之缓解。

2.5 内皮细胞源性外泌体与骨修复

骨组织再生与血管形成同样有着密不可分的联系。内皮细胞可以促进血管再生，对血管完整性的建立和维持至关重要。内皮细胞源性外泌体含有miRNA-214，一种调控血管生成和内皮细胞功能的活性因子，在作用于相邻内皮细胞后，可抑制内皮细胞凋亡并促进其迁移，最终促进血管形成[34]。研究[35]表明，老年或骨质疏松患者内皮细胞来源外泌体包含有miRNA-31，骨髓MSCs经miRNA-31作用后成骨分化被抑制。上述研究提示，内皮细胞对成血管与成骨作用呈相反的生理效应，该两种生理功能是否相互制约或如何达到平衡状态从而使骨缺损得到有效修复仍有待研究。

综上所述，骨缺损修复包括炎性调节、血管形成及骨组织再生改建等生理过程，骨环境中的DC、干细胞、OB、OC与内皮细胞可通过分泌外泌体从上述不同过程参与调节骨修复，外泌体因为其独特的生物学性质，可能成为骨缺损疾病治疗的有效途径[36-37]。应用外泌体修复骨缺损的方法相对于传统骨移植有诸多优势，如可通过膜融合的方式被受体细胞内化并利用；含有多种具有成骨作用的活性因子；可近程或远程传递并作用于靶细胞，其囊泡结构可以避免其包含的小分子物质在传递过程中被降解；可避免免疫排斥；可与多种生物材料联合用于修复骨缺损[38]。

然而，外泌体的应用仍具有一定的局限性。目前，外泌体对骨缺损修复的体内体外研究大多只针对局部因素或某单一类型细胞对骨再生的作用，而其系统性的解释和机制并未得到有效证明；不同细胞源性外泌体对骨缺损修复可表现出相同或相反的效应，而这些外泌体如何相互促进或相互抑制目前并没有得到明确解释；外泌体携载成分及其如何作用靶细胞的具体机制也尚未得到确切阐明。

不同细胞源性外泌体可通过调节炎症反应、促进成骨分化、抑制破骨功能、促进血管再生从而促进骨组织形成，为骨缺损的治疗提供新思路和新方法。外泌体包含多种生物活性因子，对其进一步的性质与功能分析可为开发骨缺损修复的治疗性外泌体提供可能。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。